Böcek Virüslerinin Biyoteknolojik Önemi-The Significance of Insect Viruses in Biotechnology

Böcek virüsleri, böcekleri enfekte ederek, onların hastalanmaları veya ölmelerine neden olan biyolojik etmenlerdir Son yıllarda, bu virüsler modern biyoteknoloji uygulamalarında önemli ölçüde ilgi uyandırmaktadır Yüksek konukçu seçiciliklerine sahip böcek virüsleri, çeşitli tarım ve orman zararlılarına karşı kimyasal pestisitlerin alternatifi olarak kullanılmaktadır Bu virüslerle yapılan çalışmalar yüksek organizasyonlu canlılar için model olarak kullanılmaktadır Endüstriyel, zirai, tıbbı ve ekonomik öneme sahip ilgi duyulan birçok gen, bu virüslerden geliştirilmiş ekspresyon vektörlerinde bol miktarda üretilmektedir Ayrıca, son yıllarda bu virüsler gen terapi vektörü olarak da kullanılmaktadır Bu derleme makalede, başta genel böcek virüsleri olmak üzere bakülovirüslerin çeşitli biyoteknolojik çalışmalarda kullanılma potansiyelleri üzerinde durulacaktır

Abstract: Insect viruses are biological control agents that cause their illness or dead by infecting the insects Recently, these viruses have great interest at modern biotechnological applications Insect viruses that have high host specificity, have been used against various agricultural and forest pest as an alternative to chemical pesticides Studies done with these viruses have been used as model for high organizational organisms Many genes that has industrial, agricultural, medical and economical importance have been produced at great amounts at expression systems developed from these viruses Also, recently these viruses are being used as gene therapy vector At this review paper, we will pay attention on subjects especially at insect viruses, and potential of the usage of baculoviruses at various biotechnological studies

Giriş

Böcekler, dünyada en çok çeşitliliğe sahip olan hayvanlar olup, canlılar aleminin belki de en kalabalık sınıfıdır Dünyada tanımı yapılan hayvan türlerinin 4/5'ini böcekler oluşturmaktadır (URL1) Böcekler ve insanlar yeryüzünde birlikte yaşamaktadır ve bu nedenle aralarında karmaşık ilişkiler vardır Doğada yaşayan böceklerin %99'dan fazlasının insanlar için faydalı olduğu bilinmektedir Bilinen yaklaşık 1 milyon 300 bin böcek türünün, sadece %1'den daha azı doğaya ve insanlığa zarar vermektedir (URL2) Sayısal olarak az olmalarına rağmen bu zararlıların etkileri oldukça büyük olmaktadır


Çeşitli mikrobiyal etmenler böceklerde doğal enfeksiyonlar meydana getirmektedir (Tanada ve Kaya 1993, Boucias ve Pendland 1998, Charles ve ark 2000) Böcek virüsleri onların hastalanmalarına ve ölümlerine sebep olan doğal etmenlerin başında yer almaktadır (Hunter-Fujita ve ark 1998, Miller ve Ball 1998) Doğaya ve insanlara yaptıkları etkilere göre böcek virüslerini iki açıdan ele almak gerekir Bunların birincisi, ipek böceği ve bal arıları gibi insanlara ve çevreye faydalı olan böceklerin hastalanıp ölmelerine sebep olmalarıdır İkincisi ise fındık kurdu, ladin kabuk böceği, amerikan beyaz kelebeği, sivrisinek gibi çeşitli tarım ve orman ürünlerini veya insan sağlığını etkileyen zararlı böcekleri enfekte etmeleridir

Bugüne kadar çok sayıda böcek virüsü izole edilmiş ve tanımlanmıştır Sadece 800'dan fazla bakülovirüs Arthropod'lardan izole edilmiştir (Murphy ve ark 1995) Bu virüsler temel biyolojik olayların anlaşılmasına yardımcı olan araştırmaların yapıldığı önemli deney materyalleridir (Bilimoria 1991, Demir 2004) Ayrıca, böcek virüsleri tarım ve ormancılıkta zararlı böceklerle mücadelede kullanılan önemli biyolojik mücadele etmenleridir (Flexner ve Belnavis 2000, Harrison ve Bonning 2000, Sezen ve Demirbağ 2005)

Böcek virüsleri uzun zamandan beri tıbbi, ekonomik ve endüstriyel bakımdan önemli çeşitli proteinlerin üretildiği gen ekspresyon vektörleri olarak biyoteknolojide kullanılmaktadır (King ve Possee 1992, Demirbağ ve ark 1998, Demir ve ark 2000, Beljelarskaya 2002) Ayrıca son yıllarda bu virüslerin gen terapi vektörleri olarak memeli hücre sistemlerine gen transferinde kullanılmalarına yönelik çalışmalar da yoğunlaşmıştır (Ghosh ve ark 2002, Hu 2006) Bu derleme eserde böcek virüslerinin temel özellikleri hakkında genel bilgiler verildikten sonra böcek virüslerinin biyoteknolojik önemleri üzerinde durulacaktır

İsmail DEMİR1-Remziye NALÇACIOĞLU1-Zihni DEMİRBAĞ1
Karadeniz Teknik Üniv, Fen-Edebiyat Fak, Biyoloji Bölümü-Trabzon

Böcek virüslerinin genel özellikleri: Böcek virüsleri şimdiye kadar böceklerden izole edilmiş en küçük formlardır Bir nükleik asit ve bunu çevreleyen protein bir örtüye (kapsid) sahiptirler Bazılarında da nükleik asit ve kapsidi çevreleyen lipid bir zarf mevcuttur Bazı virüsler etraflarını çevreleyen protein örtünün yanı sıra başka bir protein yapı içine de gömülmüş olabilirler Bu yapı inklüzyon cisimciği olarak adlandırılır inklüzyon yapılar içerisine gömülü halde olan virüsler gömülü virüsler (OV) olarak adlandırılırlar inklüzyon yapılar şimdiye kadar sadece Baculoviridae, Reoviridae ve Poxviridae gibi virüs familyalarında tespit edilmiştir (Hunter-Fujita ve ark 1998) Böceklerden izole edilen virüslerin, genom özellikleri, kaydedildikleri konukçu takımları ve konukçularının biyolojik dönemleri Çizelge 1'de özetlenmiştir

Başta bakülovirüsler, reovirüsler, entomopoksvirüsler ve iridovirüsler olmak üzere hemen hemen bütün böcek virüsleri biyoteknolojik amaçla kullanılmaktadır (Nalçacıoğlu 2003, Demir 2004, Sezen 2004) Ancak, şu ana kadar en çok çalışılan ve biyoteknolojik amaçla en yoğun kullanılan böcek virüsleri bakülovirüslerdir (Possee 1997, Inceoğlu ve ark 2001, Kost ve ark 2005, Knipe ve ark 2007, URL3) Bu nedenle, konuların daha iyi anlaşılması için burada özellikle bakülovirüslerin özelliklerinden ve biyoteknolojik kullanımlarından bahsedilecektir

Bakülovirüslerin biyolojisi: Bakülovirüsler, 25x250 nm büyüklükte ve 80-180 kbp kapalı yuvarlak ve çift zincir, süpersarmal DNA ihtiva ederler (Hayakawa ve ark 2000, Herniou ve ark 2001, Theilmann ve ark 2005) Virüs DNA'sı, hücre zarı yapısına benzer ve karmaşık yapıda olan bir zarf ile çevrili nükleokapsid içerisine paketlenmiştir
intrasellüler virüsler, polihedra veya granula olarak isimlendirilen protein yapısında inklüzyon yapılar içerisine gömülürler Baculoviridae familyası inklüzyon yapıların şekline göre nükleopolihedrovirüs ve granulozis virüs olmak üzere iki alt cinse ayrılır (Slack ve Arif 2007) Bu gruplandırma morfolojik, serolojik ve genetik bilgilere dayanılarak yapılmaktadır

Autographa califonica nükleopolihedrovirüsü (AcNPV, Baculoviridae), ilk olarak yonca tırtılı böceğinden izole edilmiş, nükleopolihedrovirüs cinsine aittir ve en çok çalışılan örnek bir bakülovirüs tipidir (Demirbağ 1993) Tip türü olması ve bakülovirüslere ait özellikleri yansıtması nedeniyle, bakülovirüslerin biyolojileri hakkındaki bilgiler, AcNPV üzerinden verilmektedir Nükleopolihedrovirüsler, 1-18 nükleokapsidin bir zarf içerisine gömülmesiyle oluşur Daha sonra bu zarfa sahip virüsler (virionlar), polihedrin (28 kDa) denilen tek bir proteinden oluşan kristal benzeri cisimler içerisine gömülürler Bunlar polihedral inklüzyon yapılar (PIB) olarak adlandırılır

PIB içerisine gömülen virüslere gömülü virüsler (OV) adı verilir Virüse ait protein miktarının %90'ı polihedrin proteini olmasına rağmen, bu protein virüsün hücrelerde replikasyonu için gerekli değildir O sadece virüs partiküllerinin tabiat şartlarında korunmasını sağlayan matriks oluşumunda rol alır Bu nedenle, polihedrin proteinini şifreleyen polh geni, biyoteknolojik uygulamalarda bakülovirüslerin etkili bir şekilde kullanılmalarına imkan sağlamaktadır

AcNPV'nin replikasyonu enfekte hücrelerin nukleuslarında gerçekleşir (Volkman ve Keddie 1990; Demirbağ 1993; Mikhailov 2003, Slack ve Arif 2007) Şekil 1'de de görüldüğü gibi bu işlem iki aşamada gerçekleşir Birinci aşamada, nukleus içerisinde nükleokapsidler oluşur Silindir şeklindeki nükleokapsidler, kapsid denilen tüp benzeri yapı içerisinde DNA'yı içerirler Tüplerin iki ucunda taban ve kapak denilen yapılar bulunur Nukleusta oluşan nükleokapsidler sonra nukleus kanallarından geçerek sitoplazmaya ulaşır Daha sonra hücre zarından tomurcuklanma yöntemi ile zarf kazanarak hücreden ayrılırlar (Şekil 1, H, I, J) Üretilen zarflı virüsler (ekstrasellüler virüsler, BV) hücre kültüründe hücreler arasında in vitro olarak enfeksiyonu taşıma özelliğine sahip, çomak şeklinde virüs formlarıdır (Şekil 1, J)

ikinci aşamada ise nukleus içerisinde oluşan nükleokapsidlerin bir kısmı aynı yerde zarf kazandıktan sonra küp şeklindeki protein yapılar içerisine gömülerek polihedral inklüzyon yap (PIB)'ları oluştururlar AcNPV'ye ait PIB'lerin büyüklükleri 05-15 um arasındadır Polihedrin proteininden oluşan matriks, PIB'nin genel morfolojisini oluşturur PlB'ler tabiatta virüs enfeksiyonunun larvadan larvaya taşınmasında rol oynayan yapılardır

Tabiatta, inklüzyon yapılar, besinler ile birlikte beslenme yoluyla larvalar tarafından alınır Bu yapılar, yüksek alkali koşullardan dolayı ortabağırsakta çözülür ve içerisinde bulunan virüs parçacıkları ortabağırsak lümenine salınır (Şekil 1, A) Açığa çıkan virüs parçacıkları özel bir reseptör tarafından tanınır Bu tanınma sonucunda virüs parçacıkları membran füzyonu yöntemiyle ortabağırsağın tek tabakalı silindirik epitelyum hücrelerine geçer (Şekil 1, B) Sitoplazmaya ulaşan n ü kleokapsidler, F-aktin fiberleri vasıtasıyla sitoplazmadan replikasyon bölgesi olan nukleusa geçerler (Şekil 1, C) Virüs DNA'sı burada kapsid örtüden ayrılır

Bu işlem büyük ihtimalle, DNA moleküllerine tutulu olan arginin bakımından zengin bazik bir proteinin fosforilasyonu neticesinde gerçekleşir Viral DNA replikasyonu ve transkripsiyon işlemleri nukleusta gerçekleşir (Şekil 1, D)

Replikasyondan (enfeksiyondan 8 saat) sonra nükleokapsid inşaası gerçekleşir Bu işlem, yavru virüslerin, enfekte olmuş ortabağırsak hücrelerinin bazal kısmından hemolenf içerisine salınması ile sonuçlanır Daha sonra, ekstrasellüler virüs (ECV) parçacıkları, reseptör bağımlı endositozis yoluyla hemositler, bağ dokusu hücreleri, yağ dokusu, trakeal elementler, kas hücreleri ve Malpighi tüpleri gibi hemolenfe dönük olan hücreleri enfekte ederler Yeni enfekte olan hücrelerde, virüs parçacıkları endozomlar içerisine geçerler Endozom içerisindeki düşük pH, ECV zarfında mevcut olan glikoproteini (gp64'ü) harekete geçirir

Bu glikoprotein, membran füzyonunu katalizleyerek nükleokapsidlerin sitoplazmaya geçişini sağlar Bundan sonra salınan nükleokapsidler, hücre kültüründe yeni bir replikasyon işlemini başlatırlar Replikasyon işleminin ikinci basamağında (enfeksiyondan 12 saat sonra), virüs parçacıkları artık hemolenf içerisine salınmaz Bunun yerine virüsler, primer ve sekonder olarak enfekte olmuş hücrelerin nukleuslarında yeni yapılan polihedralar içerisine gömülürler (Şekil 1, E, F) Sonuç olarak, larva polihedra ile dolar, virüs tarafından sentezlenen kitinaz ve katepsinaz etkilerine yenik düşen larva ölür (Slack ve ark 1995), böylece çok sayıda PIB (108-109/larva) çevreye salınmış olur inklüzyon yapılar, mevsimsel beslenme döngülerine sahip böcek populasyonlarında virüs devamlılığında önemli bir rol oynar (Jaques 1985)

Böcek virüslerinin biyolojik mücadele materyali olarak kullanılmaları: Böcekler ve larvaları ziraat ve ormancılıkta büyük kayıplara yol açmaktadır Böceklerin bu zararlı etkilerini azaltmak veya ortadan kaldırmak için uzun yıllardan beri kimyasal insektisidler kullanılmaktadır Bu kimyasal insektisitler sadece zararlı böceklere değil, aynı zamanda zararsız ve hatta faydalı böcek ve organizmalara da zarar vermektedir

"ideal" insektisitler hakkındaki düşünceler 1970'lerden sonra iki sebepten dolayı değişmiştir Birincisi, çok sayıda zararlı böceğin kimyasal insektisitlere karşı direnç kazandığının gösterilmesidir Bu direnç, daha fazla miktarlarda pestisit uygulamalarına veya yeni ve farklı özelliklerde pestisitlerin geliştirilmesine neden olmuştur ikincisi ise bazı kimyasal insektisitlerin çok uzun süre tabiatta kalmalarıdır Bu da su ve toprağın kirlenmesine neden olmaktadır

Böylece, kimyasal insektisitler uygulandığı sahada çok uzun süre kalmaları ve yüksek organizasyonlu canlıların besin zincirine girmeleri sebebiyle insan sağlığını tehdit etmektedir Kimyasal pestisitlerin olumsuz etkileri, biyolojik olarak güvenilir alternatiflerin araştırılmasına sebep olmuştur Biyolojik mücadele, zararlı böceklere karşı predatör veya parazit, bakteri, virüs, fungus, nematod ve protozoonların veya bunların çeşitli ürünlerinin kullanılmasıyla yapılmaktadır (Fuxa 1998; Katı 2003; Fuxa 2004) Bu böcek patojenleri arasında virüsler, sahip oldukları avantajlardan dolayı biyolojik mücadelede kullanılma yoğunlukları bakımından öne çıkmaktadır (Hunter-Fujita ve ark 1998)

Virüsler arasında mikrobiyal mücadele etmeni olarak en çok bakülovirüsler tercih edilmektedir (Orlovskaya 1998; Fuxa ve ark 2002; Toprak ve ark 2005) Bu kadar çok ilgi görmelerinin nedenleri şu şekilde sıralanabilir: Bakülovirüsler çok spesifiktir Sadece belirli böcek gruplarını enfekte ederler Şimdiye kadar, bakülovirüslere karşı herhangi bir dirençe rastlanılmamıştır Bu virüslerin moleküler genetikleri detaylı bir şekilde çalışılmıştır (Herniou ve ark 2001) Ayrıca, bu çalışmalar, bakülovirüslerin genomlarının değiştirilmesine, yabancı genlerin ekspresyonlarına ve insektisidal özelliklerinin geliştirilmesine imkan vermiştir

Tabiatta bakülovirüsler, duyarlı böcek populasyonlarında sayısal olarak azalmalara sebep olur Bu virüslerin bir biyolojik mücadele materyali olarak kullanılabileceği ilk olarak 1911 'de Reiff tarafından tavsiye edilmiştir Bugün bakülovirüsler, zararlı böceklerle mücadelede doğal mikrobiyal mücadele etmenleri olarak kabul edilmektedir (Hunter-Fujita ve ark 1998) Bu amaçla kullanılmakta olan bakülovirüsler Çizelge 2'de gösterilmektedir

Yukarıda açıklandığı gibi, bakülovirüsler zararlı böceklerin biyolojik mücadelesinde kullanılabilecek mükemmel materyallerdir (McIntosh ve Grasela, 1994) Bu virüslerin geniş çapta kullanımlarını sınırlayan bazı sebepler vardır Bunların biri, fonksiyonlarını yavaş olarak yerine getirmeleridir Diğer önemli bir sebep ise enfeksiyon yapma kapasitelerinin düşük olması ve konukçu spektrumlarının dar olmasıdır Çeşitli genetik mühendisliği yöntemlerinin uygulanmasıyla, bakülovirüslerin enfeksiyonunun kısa süre içerisinde meydana gelebilmesi, insektisidal etkilerinin geliştirilmesi ve konukçu spektrumunun genişletilmesi mümkün olmuştur

Kısa sürede ölüm, az sayıda virüs üretimine yol açmaktadır Bu nedenle, kısa sürede öldüren bir virüs, dezavantaj olarak düşünülebilir Bakülovirüs ekspresyon vektör teknolojisi sayesinde, AcNPV'nin öldürme kapasitesi, böcekler için spesifik toksinler (örneğin Bacillus thuringiensis toksini), hormonlar ve hormonları ayarlayan enzimleri kodlayan gen veya genlerin virüs genomuna dahil edilmesiyle geliştirmektedir (McCutchen ve ark 1991; O'Reilly ve Miller, 1991) Stewart ve arkadaşları (1991), kuzey Afrika akrebi (Androctonus australis)'nin genomundan böcekler için nörotoksik bir protein kodlayan geni ihtiva eden bir rekombinant AcNPV oluşturmuştur Son zamanlarda yapılan çalışmalarla virüsün dokudan dokuya hareketinin, böcek ortabağırsağının primer enfeksiyonu ile başladığı, daha sonra solunum sisteminin virüsün ana güzergahı olduğu tespit edilmiştir

Böylece, enfeksiyon hedefinin değiştirilmesiyle virüsün etkisinin kısa sürede oluşması sağlanabilmektedir
Bakülovirüslerin konukçu spektrumlarının dar olması, bunların kullanımını ekonomik açıdan önemli ölçüde etkilemektedir Maliyetinin düşürülmesi için aynı virüsün birden fazla zararlı böcek için kullanılması arzu edilmektedir Virüsün konukçu spektrumunun genişletilmesi, rekombinant tekniklerin kullanılmasıyla mümkün olmaktadır Bunun için çeşitli zararlı böcekler için seçici toksik olan viral genler bakülovirüslere aktarılarak rekombinant bakülovirüsler inşa edilmektedir (Maeda ve ark 1993)

Bu nedenle, bakülovirüslerin çeşitli konukçular içerisindeki seçiciliğini belirleyen moleküler mekanizmaların tespit edilmesi gerekmektedir Bakülovirüslere ait ve böcekler için toksik olan çeşitli genler bitkilere aktarılarak bunlarda ekspresyonları sağlanmaktadır Bu sayede, zararlılara karşı dirençli transjenik bitkilerin elde edilmesi mümkündür Bu konuda yapılan çalışmalar neticesinde, Bacillus thuringiensis'e ait böcekler için toksik çeşitli genlerin aktarılmasıyla, transgenik mısır ve tütün bitkileri geliştirilmiştir (Holzman 1995, Jin ve ark 2003) Günümüzde, bu bitkiler, Amerika ve Avrupa'da başarılı bir şekilde üretilmektedir

Böcek virüslerinin gen ekspresyon vektörü olarak kullanılmaları: Tıbbi, endüstriyel ve zirai bakımdan önemli olan çeşitli viral, bakteriyal, bitkisel ve hayvansal proteinlerin, değişik özelliklerdeki ekspresyon vektörleri aracılığı ile sentezlenmeleri biyoteknolojide büyük önem arzetmektedir DNA'larından önemli proteinlerin üretilmesinde ekspresyon vektörü olarak yararlanılmalarından dolayı böcek virüsleri son zamanlarda biyoteknolojide yeni bir dönem başlatmıştır ilaç, toksin ve besin maddesi gibi çeşitli ürünleri kodlayan ilgili yabancı genler, özellikle hücre kültüründe bakülovirüslerin replikasyonu için zorunlu olmayan viral genler yerine klonlanarak, oldukça fazla miktarda üretilmektedirler (Luckow ve Summers 1988, Summers 2006, Yin ve ark 2007)
Diğer vektörlere göre bakülovirüs ekspresyon vektör sisteminin (BEVS) sahip olduğu üstünlükler ve avantajlar, bunları biyoteknolojinin önemli bir çalışma sahası haline getirmiştir

Pek çok bilim adamı tarafından halen devam ettirilmekte olan, bakülovirüslerin daha etkili bir ekspresyon vektörü haline getirilme ve virüs replikasyonunun moleküler mekanizmalarının anlaşılması çalışmaları, bunların gelecekte biyoteknolojinin daha da önemli bir materyali olmalarına yardımcı olacaktır

Bakülovirüslerin ekspresyon vektör sistemi olarak kullanılmasının en önemli üstünlüğü, polihedrin ve pl0 proteinlerini kodlayan genlerden (polh ve p70) gelmektedir Bu proteinler, enfekte olmuş hücrelerde virüs replikasyon siklusunun en geç safhasında fazla miktarda üretilir Doğada konukçular arasında virüs partiküllerini koruyan inklüzyon yapıların oluşumunda veya virüs partiküllerinin polihedrin içerisine paketlenmesinde polihedrin proteinine ihtiyaç duyulur Polihedraya, böceklerin ağız yoluyla enfeksiyonunda ihtiyaç duyulmasına rağmen, hücre kültüründeki virüs r eplikasyonunda ihtiyaç duyulmaz Bu nedenle, bu genlerin kodlayan bölgeleri çıkarılıp, yerlerine arzu edilen yabancı genler yerleştirilerek bakülovirüs ekspresyon vektör sistemleri geliştirilmekte ve bu vektörler çeşitli yabancı genlerin geniş miktarda ifade edilmesinde kullanılmaktadır

Bakülovirüslerin ekspresyon vektör sistemi (BEVS) olarak kullanılmalarına ait ilk çalışmalar, Smith ve arkadaşları (1983) ve Pennock ve arkadaşları (1984) tarafından, Autographa californica nükleopolihedrovirüs kullanılarak Spodoptera frugiperda hücrelerinde p-interferon'u ve p-galaktozidaz'ı üretmeleriyle ilgili yapılan araştırmalardır Sonraki yıllarda BEVS'i kullanılarak tıbbi, ekonomik ve endüstriyel öneme sahip viral, fungal, bakteriyal, bitkisel ve hayvansal orjinli çeşitli rekombinant proteinler bol miktarda üretilmiştir Günümüzde ise özellikle tıbbi alanda yapılan çalışmalarla çeşitli hastalıklara karşı yeni antijenler, büyüme faktörleri ve kinazlar üretilip, yaygın olarak kullanılmaktadırlar (Vlak ve Keus 1990) Geliştirilen yeni ilaçlarla birlikte yeni tedavi yöntemleri de ortaya çıkarılmıştır

Bunların sonucunda, başta rekombinant ve sentetik olmak üzere birçok yeni aşı bulunmuştur Yine bu alanda yapılan çalışmalar sayesinde immünoglobulinler, insülin, interferon ve interlökin gibi proteinler de bol miktarda üretilmiştir (Hasemonn ve Capra 1990) Endüstriyel öneme sahip çeşitli bitkisel proteinler de bu sistemde yaygın olarak sentezlenmektedir Ayrıca, zirai mücadelede zararlı böceklere karşı etkili olan bazı toksik özelliğe sahip proteinler de BEVS'de üretilerek zirai mücadele çalışmalarında kullanılmaktadır (Martens ve ark 1990)

Virüs genomuna yabancı genlerin yerleştirilme prensipleri: Bakülovirüs genomlarının büyük (80-180 kbp) olmasından dolayı, yabancı DNA'ların bakülovirüs genomuna yerleştirilmesi için bakteri veya maya vektörlerine benzer bir tarzda, restriksiyon enzimleri ve DNA ligaz kullanılarak, direkt olarak çalışmada güçlükler vardır Polh genini oluşturan virüs genomu bölgeleri, bakteriyal plazmide yerleştirilerek Escherichia coli'de veya polimeraz zincir reaksiyonuyla (PCR) çoğaltılır Daha sonra, polh geni restriksiyon enzimleri ve ekzonükleazlar kullanılarak elde edilir Promotorün hemen aşağısında sadece bir restriksiyon enzimi yeri oluşturulması, yabancı DNA'nın yerleştirilmesini kolaylaştırır Oluşturulan bu son plazmid transfer vektörü veya rekombinasyon vektörü olarak adlandırılır ve çeşitli şekillerde düzenlenir Böylece, transfer vektörü polh genine ait kodlayan bölgeden mahrum fakat, rekombinasyon için gerekli olan askı bölgelerine sahip ve işaret geni taşıyan bir plazmiddir

Şekil 2'de, ilgili bir ekzogen proteini ifade etmekte olan rekombinant bakülovirüslerin üretimi, seçimi ve izolasyonu şematik olarak gösterilmektedir Öncelikle, uygun promotor-okuma zinciri-askı bölgelerini taşıyan bir transfer vektörü, kültür edilmiş böcek hücrelerine ya yabani tip virüs enfeksiyonu sonrası ya da yabani tip virüs DNA'sıyla birlikte transfer edilir Bu enfeksiyonun ürünlerinden rekombinant virüsler seçilir ve plak saflaştırmasına tabi tutulur Saf rekombinant virüsler ilgili proteini üretmek için kullanılır
Tüm rekombinant proteinler için ideal bir gen ifade sistemi henüz geliştirilememiştir Gen ifadesinde kullanılan bakteriyal, plazmid, faj, viral ve YAC vektörlerinin her biri, rekombinant protein yapısına ve onun kullanılış özelliğine uygunluk gösterir BEVS diğerlerine göre birçok avantaja sahiptir

Bunlar, BEVS'inin protein üretimi için ökaryotik bir ortam olması, sistemde çeşitli virüs gen ürünlerinin kullanılabilmesi, sistemin güçlü gen promotorlerine sahip olması, sistemde temporal faktörlerin olması, olgunlaşmamış genlerin (örneğin, cDNA'lar) yüksek oranda ifade edilmesi, büyük genlerin ekspresyonlarının yapılabilmesi, gen ifadesinin 27°C'de meydana gelebilmesi, teknoloji basitliği, sistemin güvenilir olması ve bol miktarda üretimin yapılabilmesidir

Virüs genomuna yabancı genlerin yerleştirilme prensipleri: Bakülovirüs genomlarının büyük (80-180 kbp) olmasından dolayı, yabancı DNA'ların bakülovirüs genomuna yerleştirilmesi için bakteri veya maya vektörlerine benzer bir tarzda, restriksiyon enzimleri ve DNA ligaz kullanılarak, direkt olarak çalışmada güçlükler vardır Polh genini oluşturan virüs genomu bölgeleri, bakteriyal plazmide yerleştirilerek Escherichia coli'de veya polimeraz zincir reaksiyonuyla (PCR) çoğaltılır

Daha sonra, polh geni restriksiyon enzimleri ve ekzonükleazlar kullanılarak elde edilir Promotorün hemen aşağısında sadece bir restriksiyon enzimi yeri oluşturulması, yabancı DNA'nın yerleştirilmesini kolaylaştırır Oluşturulan bu son plazmid transfer vektörü veya rekombinasyon vektörü olarak adlandırılır ve çeşitli şekillerde düzenlenir Böylece, transfer vektörü polh genine ait kodlayan bölgeden mahrum fakat, rekombinasyon için gerekli olan askı bölgelerine sahip ve işaret geni taşıyan bir plazmiddir

Şekil 2'de, ilgili bir ekzogen proteini ifade etmekte olan rekombinant bakülovirüslerin üretimi, seçimi ve izolasyonu şematik olarak gösterilmektedir Öncelikle, uygun promotor-okuma zinciri-askı bölgelerini taşıyan bir transfer vektörü, kültür edilmiş böcek hücrelerine ya yabani tip virüs enfeksiyonu sonrası ya da yabani tip virüs DNA'sıyla birlikte transfer edilir Bu enfeksiyonun ürünlerinden rekombinant virüsler seçilir ve plak saflaştırmasına tabi tutulur Saf rekombinant virüsler ilgili proteini üretmek için kullanılır
Tüm rekombinant proteinler için ideal bir gen ifade sistemi henüz geliştirilememiştir Gen ifadesinde kullanılan bakteriyal, plazmid, faj, viral ve YAC vektörlerinin her biri, rekombinant protein yapısına ve onun kullanılış özelliğine uygunluk gösterir BEVS diğerlerine göre birçok avantaja sahiptir

Bunlar, BEVS'inin protein üretimi için ökaryotik bir ortam olması, sistemde çeşitli virüs gen ürünlerinin kullanılabilmesi, sistemin güçlü gen promotorlerine sahip olması, sistemde temporal faktörlerin olması, olgunlaşmamış genlerin (örneğin, cDNA'lar) yüksek oranda ifade edilmesi, büyük genlerin ekspresyonlarının yapılabilmesi, gen ifadesinin 27°C'de meydana gelebilmesi, teknoloji basitliği, sistemin güvenilir olması ve bol miktarda üretimin yapılabilmesidir

Böcek virüslerinin gen terapi vektörü olarak kullanılmaları: Gen terapisi, hastalıkların oluşmasına sebep olan kusurlu genleri düzeltmek için son zamanlarda geliştirilen önemli bir yöntemdir Araştırıcılar bu amaçla çeşitli yaklaşımlardan faydalanmaktadır Bunlardan en sık kullanılanı, fonksiyonel olmayan genler çıkarılıp, genomda spesifik olmayan bir yere fonksiyonel genlerin sokulmasıdır Bir başka yöntemde kusurlu genler homolog rekombinasyonla normal gen ile değiştirilebilirler Diğer bir yöntemde ise normal gen bu genin işlevinin geri dönmesini sağlayan geri mutasyon ile tamir edilebilir Ayrıca, belli genlerin regülasyonu uyarılabilir

Günümüzde, gen terapisi için böcek virüslerinin kullanılmasına yönelik çalışmalar istenen düzeyde olmamasına rağmen, bazı önemli çalışmalar mevcuttur Bu çalışmalarda gen terapisinde bakülovirüslerin kullanımının diğer gen terapisi yöntemlerine göre avantajları açıkça sergilenmiştir (Hofmann ve ark 1995; Boyce ve Bucher 1996; Ghosh 2002; Kost ve Condrey 2005; Van Oers 2006) Bunların böcek kaynaklı olmaları, insan bağışıklık sistemine cevap oluşturmamaları ve insanlarda patojen olmamaları gibi özellikleri bu virüslerin gen terapisinde kullanılma nedenlerini artırmaktadır Ayrıca, vektörlerde rekombinatların seçimine imkan veren işaret genleri, çermeleri, yapay kromozomlar gibi büyük DNA'ların aktarılabilmelerine imkan sağlamaları, çok yüksek verimlilikte rekombinasyon oluşturma kapasitelerine sahip olmaları, serumsuz ortamlarda üretilebilmeleri gibi özellikler bakülovirüsleri önemli gen terapi vektörü haline getirmiştir

Hatta bu özellikler diğer böcek virüslerinde de bulunabilir Ancak, böcek virüsleriyle yapılan gen terapisi çalışmaları günümüzde bakülovirüslerle sınırlı olup, diğer böcek virüsleri bu anlamda henüz çalışılmamıştır Bakülovirüslerin bu alandaki çalışılma avantajları, diğer böcek virüslerinin de etkili bir şekilde gen terapisinde kullanılabileceği yönündeki görüşleri güçlendirmektedir Bu nedenle, diğer böcek virüslerinin gen terapisi çalışmalarında kullanılması yönünde detaylı çalışmalara ihtiyaç vardır

Sonuç

Yukarıda da belirtildiği gibi, böcek virüsleri son yıllarda zirai mücadele, moleküler biyoloji, gen ekspresyonu ve gen terapisi alanlarında tüm dünyanın ilgisini çeken, bilimsel çalışma materyalleri haline gelmişlerdir Bu virüslerin, sadece bir alanda değil, çok yönlü olarak insanlığa hizmet etmekte oldukları görülmektedir İnsanlık belki de bu virüslerden yararlanmanın henüz başlarındadır Moleküler genetik ve biyoteknoloji alanlarındaki baş döndürücü bir hızla meydana gelen gelişmeler, böcek virüslerini gelecekte çok daha popüler hale getirecek ve çok daha etkin bir şekilde insanoğlunun hizmetine sunacaktır