Mayalarda Gen Klonlaması

Mayalardan, özellikle, Saccharomyces cerevisiae, ökaryotik hücre karakteri taşıması, laboratuarlarda kolayca üretilebilmeleri, genetik düzeyde manipulasyonların yapılabilmesi, patojenik olmaması gibi nedenlerle, üzerinde fazla çalışmalar yapılmıştır Aynı zamanda non-saccharomyces mayalar ve flamentöz mantarlarda da genetik düzeydeki araştırmalar sürdürülmektedir
Scerevisiae, diğer maya, bakteri, virus ve ökaryotiklerin bazı önemli genlerinin klonlanmasında da büyük kolaylıklar ve yarar sağlamaktadır Son yıllarda, insanlarda tehlikeli infeksiyonlara yol açan Hepatitis B virus’una karşı aşı hazırlamada Scerevisiae kullanılmıştır

MAYALARA AİT BAZI PLASMİDLER VE GENEL ÖZELLİKLERİ

Scerevisiae’in ve diğer maya hücrelerinin ekserisinde doğal plasmidler bulunmaktadır Bunlardan biri 2 mikrometre DNA plasmidi olup, yaklaşık 6300 baz çifti uzunluktadır Buna, bakteri plasmidi selektif marker sekansları ile replikasyon orjini ilave edilerek oluşturulan hibrit rekombinant plasmid daha stabil bir karakter gösterir ve S cerevisiae’ye kolaylıkla transforme olabilir Başlıca suni plasmidler; (sekil 1a, 1b, 1c, 1d)

1)Maya integrasyon plasmid (Ylp) vektörleri: Bu plasmid, Ecoli’ye ait pBR322 plasmidi taban olarak kullanılarak elde edilmiştir Ylp’de pBR322’ye ait ampR geni ve replikasyon orijini ile mayaya ait bir marker gen ura3 (veya his3, leu2) bulunmaktadır
2) Maya replikasyon plasmid (YRp) vektörleri: Bu plasmid de ampR, ura3, ve ars (autonomously replicating sequence) genleri bulunmaktadır (episomal plasmid)
3)Maya sentromerik plasmid (YCp) vektörleri: Bu vektör episomal plasmide, cen3 geninin ilavesiyle elde edilmiştir Bu plasmidin replikasyon ve segregasyonu diğerlerinden daha iyidir
4)Ekspresyon plasmid vektörleri: yabancı genlerin maya hücresi içimde en iyi bir tarzda ekspresyonunu sağlamak için vektörlere maya regulatör genleri katılarak elde edilen suni plasmidler daha etkindirler Bu tarzda hazırlanan bazı plazmid vektörler insan interferon geninin klonlamasında kullanılmışlardır Böyle plasmidlere, regulatör gen olarak fosfogliserate kinas-5 (PGK) geni ile pBR322’ye ait ampR genide katılmaktadır
Mayalara ait iyi bir mekik vektörde (bifonksiyonel plasmid vektörler) pBR322’ye ait bir marker gen (ampR) ve replikasyon orijini ile mayaya ait marker genler (cen3, ura3, ars) ve replikasyon orijini bulunmaktadır Ayrıca, kendilerine gen aktara bilmek için de restriksiyon kesim yerine sahiptirler

YAPAY KROMOZOM (Artificial chromosomes, ACs) VEKTÖRLERİ

İnsan moleküler genetiğinde son birkaç yıl içinde gerçekleştirilen gelişmelere bağlı olarak kosmidlerde klonlanabilen fragmentlerden daha uzun (100-200 kb ) fragmentleri klonlanabilecek vektörlere de ihtiyaç duyulmuştur Bu amaçla yapay olarak çeşitli hücre kromozomlarından vektörler hazırlanmıştır Son yıllarda maya genetiğinde gerçekleştirilen başarılarla yüzlerce Kb uzunluğundaki bu yönteme Yeast Artifisial Chromosomes (YACs) adı verilmektedir YACs’larda 0bakteriyel plazmidler bulunmaktadır, ancak farklı olarak iki maya telomeri, bir maya sentromeri, otonom olarak replike olan diziler (autonomously replicating sequences, ARS), seçici markerlar ve klonlama bölgesi bulunmaktdır (Şekil 2)
Hemen bütün ökaryotlarda bulunan ARS’lar replikasyon için gerekli orijinleri sağlarlar Bu noktalar ve parçalar iki kolun oluşumuna neden olurlar Bir kolda bir telomer ile seçici marker, diğerinde ise başka bir marker ve hem sentromer hem de telomer bulunur Uzun DNA fragmentlerinin bu kollara eklenmesi ve maya transformasyonu ve sonrada seleksiyonu ile sentetik kromozomlar oluşur Uzunluklarına rağmen bu fargmentler orijinal genomik DNA’nın doğru bir representasyonunu vermektedir Kromozomlara özgül YACkütüphaneleri sayesinde insan genomunun haritalanma çalışmaları artmış bulunmaktadır Yapay kromozomal vektörler maya kromozomlarından başka bakteri kromozomu (BAC’s), P1 bakteriyofaj türevi kromozomları (PAC’s) ve memeli kromozomları (MAC’s)’ndan oluşturulabilmektedir

REKOMBİNANT VEKTÖRÜN KONAKÇI ORGANİZMAYA SOKULARAK KLONLANMASI

Yabancı DNA fragmentinin uygun bir vektöre aktarılmasından sonraki basamak Rekombinant vektörün konakçı hücreye aktarılmasıdır Rekombinant DNA teknolojisinde E coli, özellikle de K12 suş’u en çok kullanılan konakçı organizmadır Bunun yanısıra Bacillus subtilis ve Saccharomyces cerevisiae da kullanılan organizmalardır Özellikle B subtilis nonpatojen olduğundan çalışmalarda oldukça güvenilir bir mikroorganizmadır Diğer taraftan mayanın avantajı ise ökaryot olması ve kültürünün kolay yapılması, son yıllarda bu organizmaya ilişkin büyük gelişmelerin olmasıdır
Rekombinant plazmidler oluşturmak için bir plazmid; bakterinin parçalanması ve santrifüj edilmesi yolu ile bakteriden izole edilir Sonra bakteriyel DNA ve debris atılır Plazmid DNA’sı ile yabancı DNA uygun bir RE’ne maruz bırakılarak karıştırılır ve ligaz enzimi ile muamele edilirse rekombinant plazmid (chimera) oluşturulur Sonra yabancı DNA’yı inkorpore etmeden plazmidin tekrar sirküler hale gelmesini azaltmak için alkalen fosfataz ile muamele edilir Bakteri hücresi CaCl2 ile muamele edilerek bakteri membranı plazmid DNA’sına geçirgen hale getirilir Bu yolla rekombinant plazmid DNA’sının bakteriye sokulması işlemine transformasyon adı verilir Transformasyon sonrası transforme olmuş konakçı agar ortamında büyütülür
Uygun koşullar altında bakteri yaklaşık her 20 dakikada bir bölünür ve birkaç gün sonra milyonlarca bakteri kolonisi oluşur Bunlar agar ortamında önce farklı koloniler halindedir ancak kültür devam edince koloniler birbirlerine girerler Burada önemli olan nokta hücrelerin her kolonisi tek bir hücreden köken alır ve bu nedenle kolonideki tüm hücreler aynı genetik yapıya sahiptirler Bunlara hücre klonu adı verilir Klondaki her hücre sokulan aynı DNA segmentini içermektedir Böyle bir koloni alınıp başka bir petri kabında kültüre edilirse, bu yeni kültürdeki tüm kolonilerde aynı DNA baz dizisini içerirler ki işte bu işlem klonlama olarak adlandırılır(Şekil 3)
Gen klonlanmasında klonlanan DNA parçasının oluşturduğu proteinin bilinip bilinmemesi durumuna göre iki farklı strateji, iki farklı uygulama ortaya konmuştur Bunlar kısaca şöyle özetlenebilir;

1)Fonksiyonel klonlama; Klonlanmak istenen DNA fragmentinin kodladığı proteinin bilindiği duruma göre yapılan uygulamalardır Genin fonksiyonuna yönelik eldeki bilgilerden yola çıkılır Bu uygulama türünde incelemeye alınan proteinin hangi protein olduğu tanımlandıktan sonra peptit dizisine bakılarak bu proteinin amino asit yapısı belirlenebilir Bu bilgiden hareketle söz konusu proteinin amino asitlerini kodlayan DNA’nın nükleotid diziside belirlenebilir (Şekil 4a) Ancak bazı amino asitlerin birden fazla kodon tarafından kodlandığı unutulmamalıdır Üzerinde çalışılan bir proteinin amino asitlerini kodlayan nükleotid dizisi yani DNA fragmenti sentetik olarak elde edilebilir Sentetik yolla elde edilen bu DNA parçaları yaklaşık 17 bç uzunluğunda olup oligonükleotid prob olarak kullanılmaktadır

2)Pozisyonel klonlama; Subkromozomal pozisyonu bilinen bir geni izole etme anlamındadır Genin kodladığı proteinin ne olduğu bilinmediği durumlarda uygulanan bir yöntem olup, bilinmeyen bir genin öncelikle gentik pozisyonuna göre lokalizasyonu yapılıp ardından klonlanmasına pozisyonel klonlama denir Bu yöntemde ilk kademe;Genetik haritalama yöntemlerinde biri kullanılarak incelenen genin ilgili kromozomdaki lokalizasyonunu belirlemektir Daha sonra flanking DNA markerleri referans noktalar olarak kullanılarak ara DNA fragmentleri fonksiyonel genin bulunmadığı açısından incelenir Bu genlerin varlığına ip uçları hipo metilasyonlu CpG adacıklarının görülmesi ile elde edilir Bu yolla gen klonlanlanması yapılarak hem hastalardaki çeşitli mutasyonlar hemde nükleotid dizisi belirlenen proteinin yapı ve fonksitonu ortaya konmaktadır (Şekil 4b ve 5)
NOT: Sonyıllarda kistik fibrozis ve nörofibromatozis gibi hastalıkları oluşturan mutant genler pozisyonel klonlama ile tespit edilmiştir

SPESİFİK DNA FRAGMENTİ İÇEREN KOLONİLERİN (KLONLARIN) SEÇİMİ

Gen teknolojisinde klonlama yapıldıktan sonra uygulanması gereken işlem spesifik DNA dizisi içeren kolonilerin seçimidir Bu işlem birkaç basamaktan oluşmaktadır:

1)Vektörlü kolonilerin seçimi işlemi: Antibiyotik dirençliliği tayini yada Plaka oluşumunun gözlenmesiyle vektörlü kolonilerin seçiminde ilk basamak vektörün inkorpore olduğu bakteri kolonilerinin yani transformasyonun yada transfeksiyonun gerçekleştiğinin belirlenmesi işlemidir Eğer antibiyotiğe dirençlilik geni taşıyan plazmid ile transformasyon gerçekleşmiş ise kolonilerin antibiyotiğin bulunduğu ortamda büyümesi gereklidir Dolayısıyla dirençli koloniler aranan kolonilerdir Antibiyotik dirençlilik tayini eğer vektör olarak faj kullanılmış ise o takdirde plaka oluşumuna dikkat edilir

2)Rekombinant vektörlü kolonilerin seçimi: antibiyotik dirençliliği yada Xgal testi ile koloni seçiminde koloni seleksiyonu ve koloni filtre hibridizasyonu yönjtemi uygulanır
Koloni seleksiyonu: Vektörlü kolonilerin seçiminde ikinci basamak yabancı DNA’nın vektörde bulunup bulunmadığının belirlenmesidir Plazmidin kullanıldığı kolonilerde antibiyotiğe dirençliliğin gelişip gelişmediği incelenir Örneğin; pBR322 plazmidinde eğer yabancı DNA başarılı olarak Pstl bölgesine inkorpore olmuşsa, bu bölgede bulunan ampisiline dirençli genin parçalanması (inaktif olması) ve Ampisilinin bulunduğu kültürde kolonilerin büyümemesi gerekir Bu şekilde orijinal tabakada rekombinant koloniler toplanır ve ayrı ayrı kültüre edilirler Vektör olarak faj kullanıldığında ise belirli soylar bir chromogenic madde (Xgal = 5 bromo-4 chloro-3-indoyl-beta-D-glactopyronoside) varlığında normal olarak mavi plaklar oluşturur Ancak yabancı DNA bu renk değişiminden sorumlu gene başarılı olarak girmişse konakçı organizma Xgal’ı ayrıştırmaz kolonilerin etrafı renksiz olarak görülür Bu tür koloniler seçilir ve saf olarak üretilir
Koloni filtre hibridizasyonu: Bu yöntemde yabancı DNA taşıyan rekombinant bakteriler nitroselüloz kağıdı ile kaplı petri besiyerinde büyütülmekte ve filtre üzerindeki yüzlerce koloni 0,5 N NaOH ile muamele edilerek bakterilerin lizis olması sağlanmaktadır Lizis sonucunda hücre dışına çıkan DNA’nın iki sarmalı NaOH ile işlem nedeniyle birbirinden ayrılarak tek sarmallı hale gelmaktedir Tek sarmallı DNA’nın nitroselüloz kağıdına sıkıca tutunma-bağlanma özelliği bulunmaktadır Filtreler daha sonra 32P ile işaretli prob DNA ve RNA ile hibridizasyona tabi tutularak hibridizasyonu sonucu otoradyografi ile gözlenmektedir Eğer hibritleme varsa bu duyarlı film üzerinde koloni büyüklüğünde siyah noktalar gözlenecektir (Şekil 6)

SPESİFİK DNA BAZ DİZİLİ REKOMBİNANT KOLONİLERİN SEÇİMİ

Bu işlem 6 değişik yöntemle (Genetik yöntem, Komplementasyon yöntemi, Immunolojik yöntem, Uygun prob ile hibridizasyon, Hibrid-arrested protein translasyonu ve Elektron mikroskobu ile) gerçekleştirilir
Rekombinantların oluştuğu koloniler belirlenince, diğer basamak spesifik DNA baz dizisi içeren rekombinantların tanımlanması gerekir Bu aşamada değişik yaklaşımlardan yararlanılır:

Genetik yaklaşım: Bu yaklaşımda uygun bir vektörle konakçıya sokulan DNA’nın ekspresyonu incelenir Konakçı organizma olan Ecoli bakterisine sokulan gen, inkorpore olan DNA’nın sentezleyebileceği özel bir büyüme faktörüne gerek duyan Ecoli soyunda metabolik defekt ortaya koyacaktır Transformantlar uygun kültür ortamı kullanılarak seçilebilir

Immunolojik yaklaşım (Klon seçiminde antikorların kullanımı): Bu yaklaşımdan yararlanabilmek için inkopore olan DNA’nın oluşturduğu antijenlere karşı antikorların olması gerekir Plastik tabaka spesifik antikorlarla kaplanarak lizise uğramış bakteriyel kolonilerin yüzeyine yavaşça uygulanır Burada belirli bir antijen sentezleyen koloniler antikora bağlanacaktır Antijen daha sonra radyoaktif olarak işaretlenmiş ikinci bir antikor ile muamele edilir ve otoradyografide incelenir İnceleme sonunda belirli antijeni sentezleyen koloniler belirlenir Örneğin; insan insülin geni bakteride klon edilmiş olsun Yüzlerce bakteri kolonisi içinde insülin yapan koloninin olup olmadığı antikor kullanarak bulmak mümkündür Bunu için önce insülin enjeksiyonla tavşana verilip tavşan serumundan antikor elde edilir Ayrıca insüline özgü elde edilen antikor proteinleri I125 izotopu ile işaretlenir Sonra petri kabı üzerindeki bakteri kolonileri lizis edilerek içindeki tüm maddelerin açığa çıkması sağlanır Her koloni PVC yüzeyine kaplanmış antikor ile muamele edilir Eğer kolonilerden herhangi birinde insülin yapılmışsa bu antikor ile birleşir PVC yüzeyi I125 ile işaretli antikor ile muamele edildiğinde yalnızca insülin yapan koloniye ait olan yerlerde radyoaktivite izlenir ve koloni bulunmuşolur
Uygun prob ile hibridizasyon: Diğer bir yaklaşım uygun bir prob’la spesifik yabancı DNA dizisinin hibridizasyonu yoluyla klonların belirlenmesidir Koloni hibridizasyonunda nitroselüloz filtre, bakteri kolonileri yada faj plakları üzerine konur Filtre bu kolonilerden bir miktar DNA’yı absorbe ettikten sonra DNA denatüre edilir ve filtre daha sonra aranan gene komplementer olan radyoaktif işaretli DNA probu ile birlikte inkübe edilerek hibridizasyon gerçekleştirilir Hibridizasyon sonrası filtredeki fazla prob yıkandıktan sonra hibritleri taşıyan filtre X ışınına maruz bırakılır, koloninin pozisyonu tabaka da işaretli olarak belirlenir

Hibrid-arrested protein translasyonu: Diğer bir yaklaşım hibrid-arrested protein translasyonu yöntemidir Bu yöntemde eğer DNA baz dizisi eksprese olmuşsa klondan ekstre edilen DNA’nın in vitro translasyonu değişik yöntemler aracılığıyla incelenir Klondan ekstre edilen DNA denatüre dilerek, önce tek sarmal hale getirilir, daha sonra dokudan elde edilen saflaştırılmamış mRNA ile karıştırılır RNA ile DNA hibridizasyonu gerçekleşir DNA-RNA karışımı mRNA’dan protein sentezinin gerçekleşmesi için gerekli her şeyin bulunduğu tavşan retikülosit lizatı gibi bir translasyonal sisteme konulur ve sonuç gözlenir

KLONLANAN SPESİFİK DNA FRAGMENTİNİN TANIMLANMASI

Yabancı DNA fragmenti taşıyan Rekombinant vektörlü bakteriler önce üretilir Daha sonra bakteri içindeki rekombinant vektörler bakterilerden izole edilir Bu aşamadan sonra daha önce klonlama için kullanılmış aynı RE ile bu vektör kesilerek klonlanan DNA fragmenti vektörden ayrılır
Klonlanan DNA fragmentinin uzunluğunun ölçülmesinde daha önceden uzunluğu bilinen DNA parçalarından faydalanılır Bunlara marker DNA denir Klonlanan DNA fragmenti ile marker DNA agaroz jelde birlikte (-) kutuptan (+) kutba doğru yürütülür Sonuçta klonlanan DNA fragmentinin uzunluğu kabaca belirlenmiş olur Agaroz jel elektroforezi DNA parçalarını uzunluklarına (molekül ağırlıklarına) göre ayıran bir sistemdir Kısa olanlar daha hızlı uzun olanlara ise daha yavaş hareket ederler (Şekil 7) Klonlanan DNA fragmentinin uzunluğu kendisi ile birlikte jelde yürütülmüş marker genin büyüklüğüne ve bç sayısına bakılarak tanımlanır

KAYNAKLAR:

1Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler, Nobel Tıp Kitapevleri 2Baskı, Prof Dr Güler Temizkan
2Kükem Derneği Bilimsel Yayınları No:3, Biyoteknoloji (3 Baskı) Prof Dr Mustafa Arta, 1995, Ankara
3Tıbbı Genetik Ders Kitabı, Güneş ve Nobel Tıp Kitapevi, ProfDr Nurettin Başaran
4Thompson & Thompson Tıbbı Genetik, Çeviren: ProfDrEngin Yılmaz, Nobel Tıp Kitapevi