Dna Dizileme (Dna Dizi Analizi)

DNA Dizileme (DNA Dizi Analizi)
Vikipedi, özgür ansiklopedi

DNA dizi analizi veya DNA dizileme, gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında birçok bilgi edinmemizi sağlamıştır 1940'larda DNA baz kompozisyonu saptama yöntemleri bulunmasına karşın DNA'daki nükleotid dizilişlerinin doğrudan kimyasal analizi 1960'larda geliştirilip kullanılmaya başlanmıştır İlk yöntemler, proteinlerdeki amino asit dizisinin saptanmasında kullanılanlara dayanıyordu Bunlar zor ve zaman alıcı yöntemlerdi Örneğin, 1965'te Robert Holley, 75 nükleotidlik bir tRNA molekülünün dizisini bir yıllık bir çalışma sonucu saptayabilmişti
1970'lerde daha etkin ve doğrudan nükleotid dizi analizine yönelik yöntemler geliştirilmeye başlanmıştır Herhangi bir organizmadan çok miktarda saf DNA fragmanları elde edilmesini sağlayan rekombinant DNA tekniklerinin gelişmesine paralel olarak dizi analizi yöntemleri de geliştirilmeye başlanmıştır Allan Maxam ve Walter Gilbert'in kimyasal yöntemi DNA'nın belirli bazlardan kırılmasına dayanmaktadır Fred Sanger ve arkadaşlarının geliştirdiği ikinci yöntemde ise belirli bir bazda sonlanan bir DNA zinciri sentezi gerçekleştirilmektedir Bu yönteme dideoksinükleotit yöntemi de denmektedir
Walter Gilbert ve Frederick Sanger DNA dizi analizi üzerine yaptıkları çalışmalardan dolayı 1980 yılında kimya alanında Nobel ödülü kazanmışlardır
Her iki yöntemde de dizisi saptanacak DNA'ya dört ayrı reaksiyon uygulanmaktadır (her baz için bir tane) Bu dört reaksiyonun ürünleri, bir nükleotid uzunluğu kadar farklı, bir dizi DNA parçacıklarıdır Dört reaksiyonun ürünleri bir jelde dört ayrı kuyucukta yan yana elektroforez ile ayrıştırılmaktadır Jel hattındaki her bir bant belirli bir baza karşılık gelmektedir ve jeldeki bantlardan DNA parçacığının dizisi okunabilmektedir
Maxam-Gilbert yönteminde, dizisi saptanacak DNA parçacığının komplementer zincirleri ayrılıp, 5?- ucundan, polinükleotid kinaz enzimi kullanılarak dnaanalizpng ile işaretlenir Bu işaret, elektroforez sonrası belirli bir DNA parçacığının tanınmasını sağlamaktadır İkinci adımda ise, dört ayrı tüpteki DNA örneğine, zinciri belirli nükleotidlerden kıran dört ayrı kimyasal reaksiyon uygulanır Reaksiyon için kısıtlı bir süre verilerek her tüpe farklı pozisyonlardaki hedef nükleotidlerden kırılmış moleküller elde edilir Sonuçta, kırıldığı noktaya göre, hepsi 5?- ucundan işaretli ancak boyları farklı bir dizi parçacık elde edilir
DNA'nın kırıldığı dört farklı reaksiyonda, guaninden (G>A), adeninden (A>G), yalnız sitozinden [C] ya da sitozin ve timinden (C+T) kırılma olur Bu reaksiyonlarda, purinlerin kırılmasında dimetilsülfat kimyasalı kullanılır Nu reaktif, adenine göre guanini daha etkin olarak metiller ve ısı uygulandığında zincir metillenmiş bölgeden kırılır Bu durumda daha çok guaninden zincir kırılması gerçekleşir (G>A) Asit ortamında ise bunun aksine adeninden kırılan zincirler daha fazladır (A>G) Pirimidinlerin kırılma reaksiyonlarında hidrazin kullanılır Hidrazin DNA'yı hem sitozin hem de timinden kırar Ancak yüksek tuz derişiminde (2M NaCl) yalnız sitozin reaksiyona girer Böylece iki reaksiyondan biri sitozini [C] diğeri sitozin ve timini (C+T) belirlemektedir
Dört reaksiyon setinden elde edilen parçacıklara elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana yürümeleri sağlanır Reaksiyonların her biri hedef bazdan kırılmış ancak farlı uzunluklarda parçacıklar içermektedir Uygulana elektriksel alanın etkisi ile farklı uzunluklardaki parçacıklar jelde en kısası önde gitmek üzere yol alır DNA parçacıklarının 5?- ucu radyoaktif işaretli olduğu için, elektroforez sonrası jelin üzerine röntgen filmi konulup gerekli süre bekletilerek otoradyografi yapılır Görüntülenen bantlar aşağıdan yukarıya doğru okunur
Enzimatik DNA sentezine dayanan Sanger'in DNA dizi analizi yönteminde, dizisi saptanacak olan DNA zinciri için kalıp olarak kullanılır Sentez reaksiyonu DNA polimeraz 1 ile kataliz edilir Yöntemde, kimyasal değişikliğe uğratılmış (modifiye) dideoksinükleotid trifosfatlar kullanılarak bir dizi DNA parçacıkları elde edilir Dideoksinükleotid trifosfatlarda 3'-OH gurubu bulunmaz Bu durumda, molekül yeni sentezlene DNA?ya katılır ancak 3?-OH gurubu taşımadığı için kendisine nükleotid ilave edilemez ve zincir sentezi sonlanarak bir DNA parçacığı elde edilir Deneyde, dört reaksiyon karışımı hazırlanır Her bir reaksiyon karışımı kalıp DNA zinciri, bir primer, radyoaktif nükleozit trifosfatların dördü ve az miktarda dideoksiribonükleozit trifosfatlardan sadece birini içerir Zincir sonlanması için dört reaksiyon tüpünde farklı bir dideosiribonükleozit trifosfat bulunur Reaksiyonların her birinde çok az miktarda modifiye nükleozit kullanıldığı için yeni zincir sentezi rastgele sonlanarak, bir dizi DNA parçacığı meydana getirir
Sentez sonrası, dört reaksiyondan elde edilen radyoaktif DNA parçacıklarıelektroforez jelinde yan yana dört ayrı kuyucukta yürütülür DNA bantları otoradyografi görüntülenir ve ve Maxam-Gilbert yönteminde olduğu gibi jel aşağıdan yukarı doğru okunarak nükleotid dizisi saptanır
DNA dizi analizi ile birçok organizmanın genlerinin yapısı ve organizasyonu hakkında önemli bilgiler elde edilmiştir Virüslerin tüm genomları, E coli ve maya gibi birçok organizmanın genomları aydınlatılmıştır