Klonlama Aşamaları

Klonlama aşamaları

Rekombinant DNA teknolojisinin başlıca uygulama yöntemleri arasında gen klonlamasının önemi ve yeri çok fazladır Hatta, esasını oluşturur Gen klonlaması, basit olarak, bir genin identik kopyalarının elde edilmesi veya bir bireyden orijin alan identik projeni gruplarının oluşturulması olarak tanımlanabilir Bir tek bakterinin uygun katı besi yerinde üreyerek milyonlarca identik nesil oluşturması ve gözle görülebilecek koloni meydana getirmesi de buna örnek verilebilir Ancak bu tanım, bugün biyoteknolojide, aşağıdaki tarzda uygulamaya konulmaktadır Önemli bir ürünün (veya proteinin) sentezini kodlayan genin ait olduğu hücre (prokaryotik veya ökaryotik) genomundan (veya kromozomundan) özel yöntemlerle (genellikle, restriksiyon endonukleaz enzimleri ile) kesilerek çıkarılması, bunun bir taşıyıcı (vektör) DNA'sı ile birleştirilerek alıcı bir hücreye (prokaryotik veya ökaryotik) transfer edilmesi, bu alıcı hücrede genin ekspresyonunun sağlanmasıdır



Yukarıda kısaca tarif edilen klonlamanın olumlu sonuç verebilmesi, konu üzerinde çalışanların bilgi, becerisi ve kullanılan yöntemlere bağlıdır Birçok aşamalardan oluşan teknoloji, bu basamakların uyumlu işbirliği ile gerçekleştirilir

Gen klonlamasında önemli olan aşamalar kısaca şöyledir (genel prensipler)

1) Gen taşıyan DNA'nın (veya RNA) saf olarak elde edilmesi,

2) Genin yerinin belirlenmesi,

3) Genin çıkarılması,

4) Taşıyıcı (vektör) DNA'nın elde edilmesi,

5) Gen DNA'sının vektör DNA'sı ile birleştirilmesi,

6) Oluşan rekombinant vektör DNA'nın alıcı hücreye aktarılması,

7) Seleksiyon,

8) Gen ürününün kontrol edilmesi

02 Gen taşıyan DNA (veya RNA')nın Elde Edilmesi

Klonlamanın ilk ve önemli aşamasını oluşturan bu kısımda, istenilen ürünün iyi tarzda sentezini kodlayan geni içeren prokaryotik (veya ökaryotik) hücre genomunun (DNA veya RNA) saf ve bol olarak elde edilmesi yer almaktadır Ayrıca, gen bankalarından da yararlanılabilir

İstenilen geni taşıyan hücre bakteri ise, bu mikroorganizma katı kültür ortamlarında üretilerek, tür özelliklerini tam olarak gösteren tek bir koloni seçilir ve bunun sıvı ortamda saf kültürü yapılır Sonra, logaritmik üreme döneminde kültür santrifüje edilerek çöktürülür, tortu birkaç kez yıkanır ve bir süspansiyon elde edilir Bu süspansiyon özel yöntemlerle (kaynatmak, alkali ile muamele, SDS, vs) lize edilir Ayrıca, lizozim, proteinaz, RNaz, SDS, tris ve EDTA karışımı da kullanılarak, hücre duvarı, sitoplasmik organeller, ribosom ve proteinlerin giderilmesi sağlanır Sonra, ekstrakt pürifiye (etanol, kloroform) edilerek saf DNA süspansiyonu elde edilir Aynı amaç için diğer yöntemlerden biri de seçilebilir

DNA diğer hücre komponentlerinden daha kolay ve saf separe edilebilir Çünkü: DNA'nın kendine özgü bir kimyasal yapısı ve fiziksel özellikleri vardır

Şöyle ki:

1) Bakterilerde kromozom uzunluğu oldukça büyüktür Örn, E coli 'de kromozom 11 - 14 mm uzunluktadır 2) DNA, fiziksel ve kimyasal muamelelere oldukça dirençlidir Halbuki, diğer hücre komponentleri daha duyarlıdırlar ve kolayca tahrip olurlar

3)DNA diğer hücre komponentlerinden daha fazla dansiteye sahiptir DNA'nın bu özel karakterleri, hücre ekstraktlarından da daha kolay ayrılmasını ve pürifiye edilmesini sağlar Özellikle, alkolde iplik görünümünde bir yumak oluşturması ve cam çubuğa yapışması, ekstraktlardan kolayca ayrılmasına yardımcı olur

Bakteri DNA'sında intron bulunmadığı için, genleri kullanmak daha kolay olmasına karşın ökaryotik hücre DNA'sında intronların varlığı bunların doğrudan kullanılmasına engel teşkil etmektedir Bu dezavantajları gidermek için, hücrelerdeki olgun mRNA'lardan yararlanılır Çünkü, bunlarda intron bulunmamakta ve sadece kodlayan eksonlardan oluşmaktadır Revers transkriptase enzimi yardımı ile cDNA'ya çevrilerek kullanılırlar

Plasmid DNA'sı hazırlamak için de, sitoplasmasında plasmid içeren konak hücre (bakteri) uygun koşullarda üretilerek, kolonilerden saf sıvı kültürler elde edilir Bu sıvı kültürleri, bakteri içinde plasmid replikasyonunu artırmak için, 300 mikrogram / ml spectinomycin veya 150 mikrogram / ml chloramphenicol ilave edilerek 16-20 saat etkide bulundurulur Sonra, yukarıda bakteride bildirilen işlemler aynen uygulanarak bakteriler lize edilir ve bunlardan plasmid ve bakteri DNA'sı ekstre edilerek alınır Sonra, içinde Cesium chloride ve Ethidium bromide bulunan bir tüpe konarak santrifüje edilir Bu işlemin sonucunda kromozomal DNA üstte plasmid DNA altta toplanır Buradan plazmid DNA'sı toplanarak alınır Eğer daha fazla plasmide ihtiyaç varsa, tekrar bunlar, CaCI2 ile permeable hale getirilmiş E coli 'ye transfer edilir ve fazlaca üretimi sağlanır veya yeterli ise denemelerde kullanılır Plasmid DNA'sı elde etmede ve saflaştırmada başka yöntemlerden de yararlanılabilir

Bazı plasmidler de (pUC serisi) çok çabuk ürediğinden büyük bir sorun ortaya çıkarmazlar

Viruslara ait genetik materyal (DNA veya RNA) hazırlamak için bir çok basit veya komplike yöntemler bulunmaktadır Araştırıcılar kendilerinin olanak ve tecrübelerine göre en uygununu seçmek durumundadırlar Önemli olan nokta, virusların bol ve saf olarak elde edilmesidir Bu amaçla, virus süspansiyonlarına, etrafındaki protein tabiatındaki kapsidi veya, zarflı viruslarda da zarfı gidermek için bazı kimyasal maddelerin ve solüsyonların katılmasıdır

Genellikle, DNA ve RNA viruslarında, viruslar santrifugasyonla klasifiye edildikten sonra, tüpteki süspansiyona SDS, Proteinaz K, fenol, kloroform, isopropanol, izoamil alkol, etanol, EDTA gibi bazı kimyasal maddeler ilave edilerek viruslar etrafındaki protein tabakasından kurtarılarak sadece DNA veya RNA'lar elde edilebilir

Bakteriyofajlar için de saptanmış benzer yöntemlerden birinden yararlanılır

Genler her zaman genomik DNA veya RNA da bulunmadığı göz önüne alınarak, gerekli durumlarda hücre içindeki mRNA'dan da aynı derecede yararlanılabilir

Ökaryotik hücrelere ait genlerin elde edilmesi de yine benzer fakat özel yöntemler kullanılarak DNA'ları ekstre edilir ve saflaştırılır Sonra, RE'lerden uygun olanlarından biri ile kesilerek gen taşıyan segmentler elde edilir ve bunlar klonlamada kullanılırlar

Not: Bakteri, virus, plasmid, faj vs DNA'larını saf olarak elde edebilmek için bir çok prosedür hazırlanmış ve pratiğe konulmuştur Bunlardan birinin seçimi ve kullanılması araştırmalara bağlıdır

03 Genin Yerinin Belirlenmesi

Her ne kadar genin yerinin belirlenmesi mümkünse de, klonlamada genellikle, istenilen geni taşıyan DNA'nın (veya kısa segmentlerinin) saf bir süspansiyonunun hazırlanması, amacı gerçekleştirmede yeterli olabilmektedir

Genlerin elde edilmesinde ve yerlerinin saptanmasında bazı yöntemlerden yararlanılır Bunlar da kısaca şöyledir:

1) İn vitro sentez: Eğer istenilen gen ürünü bir protein ise ve yapısı (amino asit sayısı, türü ve sırası) biliniyorsa, bu proteini kodlayan DNA sekanslarını belirleyerek in vitro koşullarda sentezini sağlamak mümkündür Bu tarzda elde edilen DNA segmenti, klonlamada başarı ile kullanılabilir Örn, insülin ve somatostatin hormonlarını kodlayan genlerin in vitro sentezleri gibi

Bu yöntem başarılı olmasına karşın zaman alıcı ve masraflıdır Çok miktarda amino asit sayısına sahip olan proteinleri kodlayan DNA segmentleri, ayrı ayrı sentezlendikten sonra birleştirilirler Son yıllarda, özel aletler (DNA sentetizerler) yardımı ile istenilen uzunlukta DNA sekansları kolayca sentez edilebilmektedir

2) Hibridizasyon yöntemleri: Bu teknikler daha ziyade gen taşıyan DNA sekanslarının yerlerini belirlemede kullanılmaktadırlar En fazla yararlanılan yöntemler şunlardır:

a) Southern blot hibridizasyonu: Bu teknikte, materyallerden elde edilen ve bir RE ile kesimi yapıldıktan sonra oluşan saf DNA segmentlerinin agarose jel elektroforezde seperasyonu yapılır Agarose jelden sonra nitroselüloz filtresine transfer edilerek burada, işaretli (32P, biotin) problar kullanarak hibridizasyon sağlanır ve otoradiografik veya renk oluşumuna göre genin yeri belirlenir Konu üzerinde ileriki bahislerde ayrıntılı bilgi verilmektedir

Yeri saptanan DNA segmenti, agarose jel üzerinden çıkarılarak klonlamada kullanılır

b) Northern blot hibridizasyon: Bu yöntemde, agarose jel üzerine RNA separe edilerek işlemler aynen Southern blotta olduğu gibi devam ettirilir Hibrid molekülleri ortaya koymada da işaretli DNA veya RNA problarından yararlanılır

3) İstenilen genler her zaman DNA üzerinde değildir Genetik materyal olarak RNA taşıyan viruslarda, genler RNA da bulunurlar Böyle durumlarda tek iplikçik viral RNA saf olarak elde edildikten sonra, buna revers transkriptaz (RT) enzimi ile tek iplikcikli komplementer DNA (cDNA) sentezlenir Bu RNA-DNA kompleksinden RNA çıkarıldıktan sonra, bu cDNA iplikçiğine de Pol I enzimi yardımı ile ikinci bir cDNA sentezlenerek çift iplikcikli DNA molekülü haline çevrilir İşlemler, Southern blot tekniğindeki gibi yürütülür

Bazı durumlarda, geni, DNA'dan değil de, bunun bir komplementeri olan ve hücre içinde sentezlenen mRNA'dan yararlanılabilir Bu durumda mRNA'ya komplementeri olan çift iplikcikli DNA sentezlenir

Yukarıda bahsedilen ve genin yerinin belirlenmesi ve izolasyonuna yönelik çalışmalar oldukça uzun, zaman alıcı ve bazen de başarısız olabilmektedir Bu nedenle, pratikte daha etkin olan basit uygulamalar kullanılmaktadır Şöyle ki, bir RE ile kesilerek çeşitli boylarda DNA segmentleri elde edildikten sonra klonlama işlemine geçirilir ve gen taşıyan bakteri kolonileri seleksiyonla seçilerek saf olarak üretilir ve genin ekspresyonu araştırılır Aşağıda bu teknik izah edilmektedir

04 Genin Çıkarılması

DNA'larında istenen geni taşıyan bakteriler üretildikten ve DNA'ları çıkarıldıktan sonra saflaştırılır ve bir süspansiyon elde edilir Bu DNA süspansiyonu bir (veya gerekirse iki) restriksiyon endonukleaz ile muamele edilerek DNA'lar değişik boylarda olmak üzere çok sayıda segmente bölünür Doğaldır ki bu kadar çok sayıda segment (genomik DNA fragmenti) arasında istenilen (hedef) geni taşıyan sayısız sekans bulunacaktır Elde edilen DNA fragmentleri, ayrı ayrı uygun vektörle bağlandıktan sonra klonlanır Agar üzerinde oluşan koloniler, istenilen gen (hedef gen) yönünden teker teker incelenirler

Aracı moleküllerle (vektör DNA'sı ile) birleşecek olan segmentler, vektörlerin (plasmid, faj, fajmid, cosmid, vs) bakteri içindeki üremesini engellemeyecek bir boyutta ve en önemlisi de iyi eksprese olması gereklidir Bu nedenle, vektörle birleşen her DNA segmentinde istenen gen bulunmadığı gibi, gen içeren çok büyük veya küçük segmentler de vektörlerle birleşseler bile, bakteriye girmeyebilir veya girse bile eksprese olmayabilirler

Klonlamada yararlanılan bazı restriksiyon endonukleazlar bakteri genomunda kesme yaptıktan sonra oluşan segmentlerin uçları bir birinin komplementeri olup yapışkan bir özellik taşırlar (yapışkan uçlar, cohesive ends) Oluşan bu serbest uçlar tekrar birleşebilir ve sirküler bir durum alabilirler (resirkularizasyon) Bu özelliğe, vektör DNA'sında da rastlanır Her RE'nin kesiş yeri farklı olduğu gibi oluşturduğu yapışkan uçların baz sıraları ve sayıları da değişiktir

Gerek bakteriye ait DNA segmentlerinin ve gerekse vektör DNA'sının kendi aralarında tekrar birleşmesi, rekombinant DNA molekülü elde etmede güçlükler yaratmakta ve gen segmentinin vektörle birleşmesini önlemektedir Bu olumsuz duruma mani olmak için bazı metotlardan yararlanılır

Eğer genomik DNA (bakteri kromozomu), EcoRI enzimi ile kesilmişse, kesik yerlerin uçlarında birbirinin komplementeri olan ve kolayca birleşen iki yapışkan uç meydana gelir Bu durum aşağıda gösterilmiştir