Kan Gruplary - Kan Gruplary Hakkynda Bilgi

**Prof. Dr. Sinsi** · 07-14-2012

Kan Gruplary - Kan Gruplary Hakkynda Bilgi

Ülkemizde ve dünyada yaygyn olarak kullanylmakta olan kan grubu sistemleri

ABO ve Rh sistemleridir

ABO grup sistemine göre kan gruplary, A, B, AB ve O grubu diye dörde ayrylyrken, Rh sistemine göre ise, RhD Pozitif ve RhD Negatif diye ikiye ayrylyr

Her iki sistem birlikte kullanyldy?yndan, ortaya sekiz farkly kan grubu çykar

Ancak kan gruplary, sadece bununla synyrly de?ildir

Bazy ki?ilerde hem ABO grup sistemine ait alt gruplar (A1,A2,gibi) ve hem de Rh sistemine ait alt gruplar (D, d, C, c, E, e

gibi) bulunmaktadyr

Bir kanyn "Rh
Negatif" diye nitelenebilmesi için bu alt grup antijenlerinden hiçbirinin bulunmamasy gerekir

Ülkemizde CD pozitifli?ine oldukça syk rastlanyrken, DE pozitifli?i daha nadirdir

Genel olarak bakyldy?ynda Rh D pozitifli?i %85-90 arasynda de?i?mektedir

Kan bankacyly?ynda uygunluk testleri diye bilinenen testlerden biri olan kan grubu, kan ve kan komponenti transfüzyonunda son derece büyük önem ta?ymaktadyr

Eski?ehir Kyzylay Kan Merkezi'nde 1995-2000 yyllary arasynda yapylan kan grubu çaly?malarynda a?a?ydaki listede belirtilmi? ?ekilde bir da?ylyma rastlamy?tyr

Söz konusu çaly?ma, 82

292 ki?iyi kapsamaktadyr

Ülkemizde Kan Grubu Da?ylymy Grafi?i (%)
Kan GrubuA RhD PozitifO RhD PozitifB RhD PozitifAB RhD PozitifA RhD NegatifO RhD
NegatifB RhD NegatifAB RhD NegatifSykly?y% 37,8% 29,8% 14,2% 7,2% 4,7% 3,9% 1,6%
0,8

Kan grubu da?ylymynda nasyonel ve etnik bazy farklylyklar görülse de, genel olarak A ve O gruplarynyn hakimiyeti vardyr

Amerika Birle?ik Devletlerinde, ülkemizdekinin tersine O grubu daha fazla rastlanan bir gruptur

A grubu ise, ikinci syklyktadyr

Zayyf D Antijenleri (Du)
Du antijeni, beyazlarda % 0,4-1 oranynda rastlanyr ve genellikle C ve E ile birlikte bulunur

Siyahlarda ise, %3-4 oranynda rastlanmakta ve c ve e ile birlikte görülmektedir

Du eritrositler, D hücrelerinden daha az immünojeniktir

Hassas anti-D serumlarla direkt aglutinasyon ölçülebilir (Zayyf D fenotipi)

Anti D hücreleri inkübasyondan sonra indirekt antiglobulin testi ile
ölçülebilir

Kan bankalary, her Rh negatif birey, gerçekten D negatif mi, emin olmalydyrlar

Verici kany zayyf D için test edilmelidir

Alycydaki zayyf D, daha az öneme sahiptir

Zayyf D ta?yyan bir hastaya Rh negatif kan vermek, zarara neden olmaz

Kan Grubu Yçin Kan Alymy
Kan grubu tespitinde parmak ucundan alynan birkaç damla kan yeterlidir (Plak yöntemi için)

Bu i?lem syrasynda di?er i?lemlerde oldu?u gibi , sterilite son derece önem ta?ymaktadyr

Parmak ucu, uygun bir dezenfektan solüsyonla silinmeli, solüsyonun kurumasyndan sonra steril bir lanset veya otomatik delici bir alet kullanylarak delinmelidir

Parmak ucundaki kan yine steril ko?ullarda
pipetlenmeli ve antiserumla oda ysysynda kary?tyrylarak en erken 1 , en geç 5 dakika içerisinde de?erlendirilmelidir

Karar vermekte güçlük duyulan durumlarda tüp yöntemi veya di?er metodlar kullanylabilir

Transfüzyonda Kan Grubu
Kan transfüzyonunda en önemli uygunluk testlerinin ba?ynda kan grubu uygunlu?u gelmektedir

ABO Rh(D) açysyndan olasy bir hata, ölümcül bir hata olarak kabul edilmelidir

Hangi kan gruplarynyn, hangi kan gruplaryna kan verebilece?i sorusunun yanyty
Ayny Grup"'tur

Yani, A Rh(+) bir hasta, sadece A Rh(+) kan alabilir

Ayny kan gruplary içerisinde bile alt gruplardan birçok sorun ya?anabilmektedir

Zira, eritrosit yüzeyinde bugüne kadar tanymlanmy? olan 600'den fazla antijenik yapy vardyr

Bu antijenler, di?er kan grubu sistemlerini ve subgruplary olu?turmaktadyr

Okullarda anlatylan "Genel alycy" yada "Genel verici" gibi kavramlar, antijen-antikor reaksiyonlarynyn manty?y açysyndan önemlidir; ancak pratikte böyle bir uygulama söz konusu de?ildir

Tam kan, eritrosit ve trombosit süspansiyonu transfüzyonlarynda esas olan "Ayny grup"'tur

Taze donmu? plazma transfüzyonlarynda da grup uygunlu?u ?arttyr

Kan Grubu Tayin Yöntemleri

1901 yylynda Karl Landsteiner’yn ABO antijenlerini tanymlamasyndan sonra yapylan çaly?malar, kan hücrelerinin yüzeylerinde antikor yanyty olu?turabilecek çok sayyda molekülün bulundu?unu göstermi?tir

Günümüzde serolojik olarak tanymlanmy?, kan grubu antijenlerinin sayysy 600’den fazladyr

Bu antijenlerin önemli bir kysmy birbirleriyle ili?kilidir ve Kan grubu sistemlerini olu?tururlar

Bu sistemlerden ABO ve Rh, transfüzyon öncesi, uygunluk testleri kapsamynda hem alycy, hem de donörde rutin olarak çaly?ylmaktadyr

ABO sisteminde A, B, AB ve O diye bilinen 4 temel kan grubu mevcuttur

Bu kan gruplarynyn temeli eritrositlerde bulunan A, B ve H antijenlerine dayanyr

Bu antijenler, eritrositler dy?ynda, sperm, tükrük, süt, mide syvysy ve terde gibi vücut syvylarynda da bulunmaktadyr

A,B ve H antijenleri, merkezi sinir
sistemi,kemik ve kykyrdak dokuda bulunmazlar

Söz konusu antijenler, çok küçük kimyasal farklylyklar gösterirler

Antijenlerin yapysynda 15 aminoasitlik bir peptid zinciri ve bunlara ba?ly çok sayyda monosakkaritten olu?mu? bir iskeletin
sonunda syrasyyla, galaktoz, N-Asetil glukozamin ve D-Galaktoz moleküllerinin eklenmesi ile olu?an bir ön Madde bulunur

Bu ön madde sabittir ve ön maddeye eklenen farkly kimyasallarla kan grubu farklylyklary ortaya çykar

A?a?ydaki resimde kan grubu antijenlerinin kimyasal yapysy gösterilmi?tir

Kan Gruplarynyn Ara?tyrylma Teknikleri
Kan merkezlerinde eritrosit antijen ve antikor reaksiyonlarynyn gösterilmesinde RIA (Radioimmun assay) , EIA (Enzymeimmun assay) de dahil olmak üzere çok sayyda yöntem mevcuttur

Ancak, bu yöntemlerin en basit olany aglutinasyon tekni?idir

Elektrolitli ortamda eritrositlerin yüzeyindeki antijenler, ortamda bulunan özgül antikorlarla birle?ecek olurlarsa, gözle görülebilecek kümeler olu?turarak çökerler

Bu olaya Hemaglutinasyon denir

Zeta Potansiyel
Serum fizyolojik içerisinde süspanse edilen eritrositler, birbirlerine yakla?yk 25 nm uzaklykta bulunurlar

Bu uzaklyk, RBC yüzeyindeki negatif elektriksel yükün birbirine itmesi ile olu?ur

RBC yüzeyindeki negatif yükün derecesine zeta
potansiyel denir

Süspansiyon içindeki katyonlar (+ yüklü iyonlar, ör: Na+) RBC yüzeyini ku?atyrlar ve RBC yüzeyindeki negatif elektriksel yük ile onu ku?atan katyonlaryn olu?turdu?u potansiyel farky, kysaca zeta potansiyel diye nitelenebilir

Hemaglutinasyon Sonuçlaryna Etki Eden Faktörler

1

Fiziksel Ko?ullar
A

Ynkübasyon Isysy
IgM tipi antikorlar

4-27 C° (Oda ysysy)
IgG tipi antikorlar

30-37 C° (Ynkübatör)
B

Ynkübasyon Süresi
C

Santrifüj hyz ve süresi

D

Ortam pH, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller
2

Eritrositler
A

Yüzey antijenlerinin sayysy, tipi, lokalizasyonu ve immunojenitesi

B

Homozigot veya heterozigot olmalary
3

Serum
A

Protein Yçeri?i

B

Antikorlaryn Yapy ve TürleriYeni do?anlar ve yeti?kinlerin antijenik
reaktivitesi farklydyr

A ve B (Ayryca P1,Lua, Lub, Yta, Xg ve Vel)
antijenlerinin aktivitesi yeti?kinlere göre oldukça dü?üktür, ancak Rh (Ayryca
K, Fy, Jk, MNSs, Di, Do, Sc, Coa, Aua) aktivitesi, do?umda tam geli?mi?tir

Hemaglutinasyonu Kolayla?tyran Faktörler
1

Eritrositler arasy mesafeyi kysaltma

A

Proteolitik enzimler: Papain, bromelin, ficin, neuraminidase, tripsin

B

Albumin: Muhtemelen RBC yüzeyindeki negatif elektrik yükü nötralize ederek
etki göstermektedir

C

Polikatyonlar: Polybrene ve protamin gibi polikatyonlaryn eklenmesi ortamyn
katyon yo?unlu?unu artyryr ve RBC yüzeyindeki negatif yükün nötralizasyonunu
sa?lar

D

LISS (Low ionic strength solution) : Ortamdaki ion sayysyny azaltyr

E

Santrifüj: Santrifügasyon syrasynda RBC’ler birbirlerine yakla?yrlar

2

Yki eritrosit arasynda köprü olu?turma: Coombs SerumuYöntemler

Slide Yöntemi
Tüp Yöntemi
Jel Santrifügasyon Yöntemi
Mikroplate Yöntemi
Manual Polybrene Testi
Yary veya Tam Otomatize SistemlerSlide Yöntemi

ABO ve RhD antijenlerinin hyzly bir ?ekilde tanymlanmasynda kullanylyr

E?it miktarda antiserum ile parmak ucundan alynan kan veya %20’lik eritrosit süspansiyonu lam veya fayans üzerinde çevirme hareketi ile kary?tyrylyr

Eritrositlerin kümeler olu?turmasy, yani aglutinasyon olu?umu gözlenir

Tepkime yüzeyi geni? oldu?undan buharla?ma fazladyr

Bu sebeple 1-2 dakika (max

5 dakika) içinde de?erlendirilmelidir

Tüp Aglutinasyon Testi
Serum fizyolojikle hazyrlanan eritrosit süspansiyonu ile antijen bir tüpte kary?tyrylyr

1000 rpm devirle 1 dakika santrifüge edildikten sonra tekrar süspanse edilir ve aglutinasyon de?erlendirilir

Bu de?erlendirme mikroskopla veya mercekle yapylabilir

Alternatif olarak bir damla kan lama alynarak,
mikroskopla küçük büyütmede de incelenebilir

Fiziksel ko?ullar uygun olarak
hazyrlandy?ynda, sonuçlar oldukça güvenilirdir

Buharla?ma sorunu yoktur

Ystendi?inde 37 C°’de 1-2 saat inkübe edilebilir

Öte yandan RBC yykama i?lemlerinin fazla olmasy nedeniyle kont*****syon olasyly?y di?erlerine göre daha fazladyr

Jel Santrifügasyon Yöntemi
Jel testi birçok yönden tüp yöntemine benzer

Testte 5x7 cm büyüklü?ünde plastik kartlar kullanylyr

Her kartyn üzerinde 6 mikrotüp vardyr

Mikrotüplerin tabany, de?erlendirmeyi kolayla?tyrmak için konik; üst kysmy ise, inkübasyon gerektiren testler için daha geni? olarak yapylmy?tyr

Tüplerin içerisinde Sephadex-G 100 maddesini içeren bir jel vardyr

Bu madde ba?langyçta toz halindedir; ancak buffer ile kary?ty?ynda jel halini alyr

Kartlar için jel hazyrlanyrken, önce
buffer ile yykanarak ?i?mesi sa?lanyr

Daha sonra da buffer içerisinde süspansiyonu hazyrlanyr

Kullanylaca?y testin özelli?ine göre serum fizyolojik veya LISS, buffer olarak kullanylyr

Testte zaman ve hyz yönünden standardize edilmi? bir santrifüj kullanylmaktadyr

Santrifügasyon i?lemi, 70x’de 10 dakika yapylyr

Deneysel çaly?malar, santrifüj ekseninin de önemli oldu?unu göstermi?tir

Bu nedenle, eksen santrifüj gücü ile dü?ey ve yatay planda tam bir do?ru olu?turmaktadyr

Buffer ile yykama syrasynda ?i?en jel, sadece aglutine olmayan RBC’lerin geçi?ine izin verir

Aglutine olmayan eritrositler, santrifüj i?lemi syrasynda jel tabakasyny geçerek, konik kysymda çökerler

Aglutine olmu? eritrositler ise üst kysymda kümeler olu?tururlar

Kuvvetli aglutinasyonda çok büyük kümeler
olu?ur ve jel üzerinde bir tabaka meydana getirirler

Zayyf aglutinasyonda ise küçük kümeler olu?ur ve reaksiyonun ?iddetini de?erlendirmek de kolayla?my? olur

Mikroplate Yöntemi
Mikroplate yönteminde U veya V tabanly plastik 96 godeli mikrotitrasyon plaklary kullanylyr

Eritrosit süspansiyonu U pleyt için %1-2’lik, V pleyt için %0,03 konsantrasyonda hazyrlanyr

20 µL antiserum ve 20 µL eritrosit süspansiyonu godeye eklendikten sonra plak, santrifüge edilir

U pleytler çalkalanyp klasik teknikler gibi de?erlendirilirken, V tabanly pleytler 75 C°’de 10 dakika inkübe
edildikten sonra de?erlendirilir

Dü?ük konsantrasyonda eritrosit kullanyldy?y için di?er yöntemlerden daha duyarlydyr

Çok az miktarda antiserum kullanyldy?y için daha ekonomik bir metotdur

Polybrene Yöntemi
Katyonik bir polimer olan polybrene normal eritrositlerde agregasyona neden olur

Bu agregasyon ortama sodyum sitrat eklendi?inde da?ylyr

E?er eritrositler
antikorlarla kaplanmy? ise, polybrene eklendi?inde antikorlar, eritrositler arasynda köprü olu?turarak aglutinasyona neden olur

Bu ?ekilde olu?an agregasyon, sodyum sitratla da?ylmaz

Polybrene, hem manual hem de otomatik sistemlerde mikroplate veya tüpte kullanylabilir

Testte yapylacak ilk i?lem,
eritrosit yüzeyinin antikorlarla kaplanmasy için eritrosit süspansiyonu ile antiserumu inkübe etmektir

Daha sonra ortama polybrene eklenir

Agregasyon olu?umu izlenir

Santrifügasyon sonrasy supernatant uzakla?tyrylyr ve ortama trisodyum sitrat-dextroz kary?ymy eklenerek aglutinasyon de?erlendirilir

Antiserumlaryn Kalite Kontrolü
Kalite kontrolünde amaç, her i?lemi periyodik olarak kontrol ederek organizasyon hatalaryny önlemektir

Anti-A, Anti-B, ve Anti-D için günümüzde yeni standartlar olu?turulmu?tur

Bu standartlar FDA standartlaryyla e?de?erdir

A?a?ydaki tablolarda ABO ve Rh antiserumlarynyn kalite kontrol standartlary belirtilmi?tir

ABO antiserumlarynyn Kalite Kontrolü
ParametreKalite GereksinimiKontrol Sykly?yLaboratuarGörünümHemoliz, presipitasyon, partiküller ve jel formasyonu görülmemeliHergünGrup LabReaktivite ve ÖzgünlükYmmün hemoliz, rülo formasyonu veya prozone fenomeni olmamalydyr

Uygun antijenlerle kaplanmy? eritrositlerle açyk reaksiyona girmeli ve hataly
reaksiyon olmamalydyr

Her yeni serideGrup LabEtkinlikDilue edilmememi? serum, serum fizyolojikli test tüpünde %3'lük eritrosit süspansiyonuyla oda ysysynda
3-4 pozitif reaksiyon verebilmelidir

Titrasyon, A1 ve B hücreleri ile Anti-A,
Anti-B ve Anti-AB için 128; A2 ve A2B hücreleri için 64 olmalydyr

Her yeni serideGrup Lab

Rh antiserumunun kalite kontrolü
ParametreKalite GereksinimiKontrol Sykly?yLaboratuarGörünümABO Antiserumundaki GibiHergünGrup LabReaktivite ve ÖzgünlükABO antiserumundaki gibiHer yeni
serideGrup LabEtkinlikDilue edilmememi? serum, 3-4 pozitif sonuç vermelidir

Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-e, Anti-c ve Anti-CDE için R1r-, R2r-, r'r-,
r''r-RBC kullanarak 16 titrede sonuç vermelidir

07-14-2012	#1
Prof. Dr. Sinsi	Kan Gruplary - Kan Gruplary Hakkynda Bilgi Kan Gruplary - Kan Gruplary Hakkynda Bilgi Ülkemizde ve dünyada yaygyn olarak kullanylmakta olan kan grubu sistemleri ABO ve Rh sistemleridir ABO grup sistemine göre kan gruplary, A, B, AB ve O grubu diye dörde ayrylyrken, Rh sistemine göre ise, RhD Pozitif ve RhD Negatif diye ikiye ayrylyr Her iki sistem birlikte kullanyldy?yndan, ortaya sekiz farkly kan grubu çykar Ancak kan gruplary, sadece bununla synyrly de?ildir Bazy ki?ilerde hem ABO grup sistemine ait alt gruplar (A1,A2,gibi) ve hem de Rh sistemine ait alt gruplar (D, d, C, c, E, e gibi) bulunmaktadyr Bir kanyn "Rh Negatif" diye nitelenebilmesi için bu alt grup antijenlerinden hiçbirinin bulunmamasy gerekir Ülkemizde CD pozitifli?ine oldukça syk rastlanyrken, DE pozitifli?i daha nadirdirGenel olarak bakyldy?ynda Rh D pozitifli?i %85-90 arasynda de?i?mektedir Kan bankacyly?ynda uygunluk testleri diye bilinenen testlerden biri olan kan grubu, kan ve kan komponenti transfüzyonunda son derece büyük önem ta?ymaktadyr Eski?ehir Kyzylay Kan Merkezi'nde 1995-2000 yyllary arasynda yapylan kan grubu çaly?malarynda a?a?ydaki listede belirtilmi? ?ekilde bir da?ylyma rastlamy?tyr Söz konusu çaly?ma, 82292 ki?iyi kapsamaktadyr Ülkemizde Kan Grubu Da?ylymy Grafi?i (%) Kan GrubuA RhD PozitifO RhD PozitifB RhD PozitifAB RhD PozitifA RhD NegatifO RhD NegatifB RhD NegatifAB RhD NegatifSykly?y% 37,8% 29,8% 14,2% 7,2% 4,7% 3,9% 1,6% 0,8 Kan grubu da?ylymynda nasyonel ve etnik bazy farklylyklar görülse de, genel olarak A ve O gruplarynyn hakimiyeti vardyr Amerika Birle?ik Devletlerinde, ülkemizdekinin tersine O grubu daha fazla rastlanan bir gruptur A grubu ise, ikinci syklyktadyr Zayyf D Antijenleri (Du) Du antijeni, beyazlarda % 0,4-1 oranynda rastlanyr ve genellikle C ve E ile birlikte bulunur Siyahlarda ise, %3-4 oranynda rastlanmakta ve c ve e ile birlikte görülmektedir Du eritrositler, D hücrelerinden daha az immünojeniktir Hassas anti-D serumlarla direkt aglutinasyon ölçülebilir (Zayyf D fenotipi) Anti D hücreleri inkübasyondan sonra indirekt antiglobulin testi ile ölçülebilir Kan bankalary, her Rh negatif birey, gerçekten D negatif mi, emin olmalydyrlar Verici kany zayyf D için test edilmelidir Alycydaki zayyf D, daha az öneme sahiptir Zayyf D ta?yyan bir hastaya Rh negatif kan vermek, zarara neden olmaz Kan Grubu Yçin Kan Alymy Kan grubu tespitinde parmak ucundan alynan birkaç damla kan yeterlidir (Plak yöntemi için) Bu i?lem syrasynda di?er i?lemlerde oldu?u gibi , sterilite son derece önem ta?ymaktadyr Parmak ucu, uygun bir dezenfektan solüsyonla silinmeli, solüsyonun kurumasyndan sonra steril bir lanset veya otomatik delici bir alet kullanylarak delinmelidir Parmak ucundaki kan yine steril ko?ullarda pipetlenmeli ve antiserumla oda ysysynda kary?tyrylarak en erken 1 , en geç 5 dakika içerisinde de?erlendirilmelidir Karar vermekte güçlük duyulan durumlarda tüp yöntemi veya di?er metodlar kullanylabilir Transfüzyonda Kan Grubu Kan transfüzyonunda en önemli uygunluk testlerinin ba?ynda kan grubu uygunlu?u gelmektedir ABO Rh(D) açysyndan olasy bir hata, ölümcül bir hata olarak kabul edilmelidir Hangi kan gruplarynyn, hangi kan gruplaryna kan verebilece?i sorusunun yanyty Ayny Grup"'tur Yani, A Rh(+) bir hasta, sadece A Rh(+) kan alabilir Ayny kan gruplary içerisinde bile alt gruplardan birçok sorun ya?anabilmektedir Zira, eritrosit yüzeyinde bugüne kadar tanymlanmy? olan 600'den fazla antijenik yapy vardyr Bu antijenler, di?er kan grubu sistemlerini ve subgruplary olu?turmaktadyr Okullarda anlatylan "Genel alycy" yada "Genel verici" gibi kavramlar, antijen-antikor reaksiyonlarynyn manty?y açysyndan önemlidir; ancak pratikte böyle bir uygulama söz konusu de?ildir Tam kan, eritrosit ve trombosit süspansiyonu transfüzyonlarynda esas olan "Ayny grup"'tur Taze donmu? plazma transfüzyonlarynda da grup uygunlu?u ?arttyrKan Grubu Tayin Yöntemleri 1901 yylynda Karl Landsteiner’yn ABO antijenlerini tanymlamasyndan sonra yapylan çaly?malar, kan hücrelerinin yüzeylerinde antikor yanyty olu?turabilecek çok sayyda molekülün bulundu?unu göstermi?tir Günümüzde serolojik olarak tanymlanmy?, kan grubu antijenlerinin sayysy 600’den fazladyr Bu antijenlerin önemli bir kysmy birbirleriyle ili?kilidir ve Kan grubu sistemlerini olu?tururlar Bu sistemlerden ABO ve Rh, transfüzyon öncesi, uygunluk testleri kapsamynda hem alycy, hem de donörde rutin olarak çaly?ylmaktadyr ABO sisteminde A, B, AB ve O diye bilinen 4 temel kan grubu mevcuttur Bu kan gruplarynyn temeli eritrositlerde bulunan A, B ve H antijenlerine dayanyr Bu antijenler, eritrositler dy?ynda, sperm, tükrük, süt, mide syvysy ve terde gibi vücut syvylarynda da bulunmaktadyr A,B ve H antijenleri, merkezi sinir sistemi,kemik ve kykyrdak dokuda bulunmazlar Söz konusu antijenler, çok küçük kimyasal farklylyklar gösterirlerAntijenlerin yapysynda 15 aminoasitlik bir peptid zinciri ve bunlara ba?ly çok sayyda monosakkaritten olu?mu? bir iskeletin sonunda syrasyyla, galaktoz, N-Asetil glukozamin ve D-Galaktoz moleküllerinin eklenmesi ile olu?an bir ön Madde bulunur Bu ön madde sabittir ve ön maddeye eklenen farkly kimyasallarla kan grubu farklylyklary ortaya çykar A?a?ydaki resimde kan grubu antijenlerinin kimyasal yapysy gösterilmi?tir Kan Gruplarynyn Ara?tyrylma Teknikleri Kan merkezlerinde eritrosit antijen ve antikor reaksiyonlarynyn gösterilmesinde RIA (Radioimmun assay) , EIA (Enzymeimmun assay) de dahil olmak üzere çok sayyda yöntem mevcuttur Ancak, bu yöntemlerin en basit olany aglutinasyon tekni?idir Elektrolitli ortamda eritrositlerin yüzeyindeki antijenler, ortamda bulunan özgül antikorlarla birle?ecek olurlarsa, gözle görülebilecek kümeler olu?turarak çökerler Bu olaya Hemaglutinasyon denir Zeta Potansiyel Serum fizyolojik içerisinde süspanse edilen eritrositler, birbirlerine yakla?yk 25 nm uzaklykta bulunurlar Bu uzaklyk, RBC yüzeyindeki negatif elektriksel yükün birbirine itmesi ile olu?ur RBC yüzeyindeki negatif yükün derecesine zeta potansiyel denir Süspansiyon içindeki katyonlar (+ yüklü iyonlar, ör: Na+) RBC yüzeyini ku?atyrlar ve RBC yüzeyindeki negatif elektriksel yük ile onu ku?atan katyonlaryn olu?turdu?u potansiyel farky, kysaca zeta potansiyel diye nitelenebilir Hemaglutinasyon Sonuçlaryna Etki Eden Faktörler 1Fiziksel Ko?ullar AYnkübasyon Isysy IgM tipi antikorlar 4-27 C° (Oda ysysy) IgG tipi antikorlar 30-37 C° (Ynkübatör) BYnkübasyon Süresi CSantrifüj hyz ve süresi DOrtam pH, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller 2Eritrositler AYüzey antijenlerinin sayysy, tipi, lokalizasyonu ve immunojenitesi BHomozigot veya heterozigot olmalary 3Serum AProtein Yçeri?i BAntikorlaryn Yapy ve TürleriYeni do?anlar ve yeti?kinlerin antijenik reaktivitesi farklydyr A ve B (Ayryca P1,Lua, Lub, Yta, Xg ve Vel) antijenlerinin aktivitesi yeti?kinlere göre oldukça dü?üktür, ancak Rh (Ayryca K, Fy, Jk, MNSs, Di, Do, Sc, Coa, Aua) aktivitesi, do?umda tam geli?mi?tir Hemaglutinasyonu Kolayla?tyran Faktörler 1Eritrositler arasy mesafeyi kysaltma AProteolitik enzimler: Papain, bromelin, ficin, neuraminidase, tripsin BAlbumin: Muhtemelen RBC yüzeyindeki negatif elektrik yükü nötralize ederek etki göstermektedir CPolikatyonlar: Polybrene ve protamin gibi polikatyonlaryn eklenmesi ortamyn katyon yo?unlu?unu artyryr ve RBC yüzeyindeki negatif yükün nötralizasyonunu sa?lar DLISS (Low ionic strength solution) : Ortamdaki ion sayysyny azaltyr ESantrifüj: Santrifügasyon syrasynda RBC’ler birbirlerine yakla?yrlar 2Yki eritrosit arasynda köprü olu?turma: Coombs SerumuYöntemler Slide Yöntemi Tüp Yöntemi Jel Santrifügasyon Yöntemi Mikroplate Yöntemi Manual Polybrene Testi Yary veya Tam Otomatize SistemlerSlide Yöntemi ABO ve RhD antijenlerinin hyzly bir ?ekilde tanymlanmasynda kullanylyr E?it miktarda antiserum ile parmak ucundan alynan kan veya %20’lik eritrosit süspansiyonu lam veya fayans üzerinde çevirme hareketi ile kary?tyrylyr Eritrositlerin kümeler olu?turmasy, yani aglutinasyon olu?umu gözlenir Tepkime yüzeyi geni? oldu?undan buharla?ma fazladyr Bu sebeple 1-2 dakika (max5 dakika) içinde de?erlendirilmelidir Tüp Aglutinasyon Testi Serum fizyolojikle hazyrlanan eritrosit süspansiyonu ile antijen bir tüpte kary?tyrylyr 1000 rpm devirle 1 dakika santrifüge edildikten sonra tekrar süspanse edilir ve aglutinasyon de?erlendirilir Bu de?erlendirme mikroskopla veya mercekle yapylabilir Alternatif olarak bir damla kan lama alynarak, mikroskopla küçük büyütmede de incelenebilir Fiziksel ko?ullar uygun olarak hazyrlandy?ynda, sonuçlar oldukça güvenilirdir Buharla?ma sorunu yoktur Ystendi?inde 37 C°’de 1-2 saat inkübe edilebilir Öte yandan RBC yykama i?lemlerinin fazla olmasy nedeniyle kont***syon olasyly?y di?erlerine göre daha fazladyr Jel Santrifügasyon Yöntemi Jel testi birçok yönden tüp yöntemine benzer Testte 5x7 cm büyüklü?ünde plastik kartlar kullanylyr Her kartyn üzerinde 6 mikrotüp vardyr Mikrotüplerin tabany, de?erlendirmeyi kolayla?tyrmak için konik; üst kysmy ise, inkübasyon gerektiren testler için daha geni? olarak yapylmy?tyr Tüplerin içerisinde Sephadex-G 100 maddesini içeren bir jel vardyr Bu madde ba?langyçta toz halindedir; ancak buffer ile kary?ty?ynda jel halini alyr Kartlar için jel hazyrlanyrken, önce buffer ile yykanarak ?i?mesi sa?lanyr Daha sonra da buffer içerisinde süspansiyonu hazyrlanyr Kullanylaca?y testin özelli?ine göre serum fizyolojik veya LISS, buffer olarak kullanylyr Testte zaman ve hyz yönünden standardize edilmi? bir santrifüj kullanylmaktadyr Santrifügasyon i?lemi, 70x’de 10 dakika yapylyr Deneysel çaly?malar, santrifüj ekseninin de önemli oldu?unu göstermi?tir Bu nedenle, eksen santrifüj gücü ile dü?ey ve yatay planda tam bir do?ru olu?turmaktadyr Buffer ile yykama syrasynda ?i?en jel, sadece aglutine olmayan RBC’lerin geçi?ine izin verir Aglutine olmayan eritrositler, santrifüj i?lemi syrasynda jel tabakasyny geçerek, konik kysymda çökerler Aglutine olmu? eritrositler ise üst kysymda kümeler olu?tururlar Kuvvetli aglutinasyonda çok büyük kümeler olu?ur ve jel üzerinde bir tabaka meydana getirirler Zayyf aglutinasyonda ise küçük kümeler olu?ur ve reaksiyonun ?iddetini de?erlendirmek de kolayla?my? olur Mikroplate Yöntemi Mikroplate yönteminde U veya V tabanly plastik 96 godeli mikrotitrasyon plaklary kullanylyr Eritrosit süspansiyonu U pleyt için %1-2’lik, V pleyt için %0,03 konsantrasyonda hazyrlanyr 20 µL antiserum ve 20 µL eritrosit süspansiyonu godeye eklendikten sonra plak, santrifüge edilir U pleytler çalkalanyp klasik teknikler gibi de?erlendirilirken, V tabanly pleytler 75 C°’de 10 dakika inkübe edildikten sonra de?erlendirilir Dü?ük konsantrasyonda eritrosit kullanyldy?y için di?er yöntemlerden daha duyarlydyr Çok az miktarda antiserum kullanyldy?y için daha ekonomik bir metotdur Polybrene Yöntemi Katyonik bir polimer olan polybrene normal eritrositlerde agregasyona neden olur Bu agregasyon ortama sodyum sitrat eklendi?inde da?ylyr E?er eritrositler antikorlarla kaplanmy? ise, polybrene eklendi?inde antikorlar, eritrositler arasynda köprü olu?turarak aglutinasyona neden olur Bu ?ekilde olu?an agregasyon, sodyum sitratla da?ylmaz Polybrene, hem manual hem de otomatik sistemlerde mikroplate veya tüpte kullanylabilir Testte yapylacak ilk i?lem, eritrosit yüzeyinin antikorlarla kaplanmasy için eritrosit süspansiyonu ile antiserumu inkübe etmektir Daha sonra ortama polybrene eklenir Agregasyon olu?umu izlenir Santrifügasyon sonrasy supernatant uzakla?tyrylyr ve ortama trisodyum sitrat-dextroz kary?ymy eklenerek aglutinasyon de?erlendirilir Antiserumlaryn Kalite Kontrolü Kalite kontrolünde amaç, her i?lemi periyodik olarak kontrol ederek organizasyon hatalaryny önlemektir Anti-A, Anti-B, ve Anti-D için günümüzde yeni standartlar olu?turulmu?tur Bu standartlar FDA standartlaryyla e?de?erdir A?a?ydaki tablolarda ABO ve Rh antiserumlarynyn kalite kontrol standartlary belirtilmi?tir ABO antiserumlarynyn Kalite Kontrolü ParametreKalite GereksinimiKontrol Sykly?yLaboratuarGörünümHemoliz, presipitasyon, partiküller ve jel formasyonu görülmemeliHergünGrup LabReaktivite ve ÖzgünlükYmmün hemoliz, rülo formasyonu veya prozone fenomeni olmamalydyr Uygun antijenlerle kaplanmy? eritrositlerle açyk reaksiyona girmeli ve hataly reaksiyon olmamalydyrHer yeni serideGrup LabEtkinlikDilue edilmememi? serum, serum fizyolojikli test tüpünde %3'lük eritrosit süspansiyonuyla oda ysysynda 3-4 pozitif reaksiyon verebilmelidir Titrasyon, A1 ve B hücreleri ile Anti-A, Anti-B ve Anti-AB için 128; A2 ve A2B hücreleri için 64 olmalydyrHer yeni serideGrup Lab Rh antiserumunun kalite kontrolü** ParametreKalite GereksinimiKontrol Sykly?yLaboratuarGörünümABO Antiserumundaki GibiHergünGrup LabReaktivite ve ÖzgünlükABO antiserumundaki gibiHer yeni serideGrup LabEtkinlikDilue edilmememi? serum, 3-4 pozitif sonuç vermelidir Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-e, Anti-c ve Anti-CDE için R1r-, R2r-, r'r-, r''r-RBC kullanarak 16 titrede sonuç vermelidir