Klonlama Aşamaları

03 Genin Yerinin Belirlenmesi

Her ne kadar genin yerinin belirlenmesi mümkünse de, klonlamada genellikle, istenilen geni taşıyan DNA'nın (veya kısa segmentlerinin) saf bir süspansiyonunun hazırlanması, amacı gerçekleştirmede yeterli olabilmektedir

Genlerin elde edilmesinde ve yerlerinin saptanmasında bazı yöntemlerden yararlanılır Bunlar da kısaca şöyledir:

1) İn vitro sentez: Eğer istenilen gen ürünü bir protein ise ve yapısı (amino asit sayısı, türü ve sırası) biliniyorsa, bu proteini kodlayan DNA sekanslarını belirleyerek in vitro koşullarda sentezini sağlamak mümkündür Bu tarzda elde edilen DNA segmenti, klonlamada başarı ile kullanılabilir Örn, insülin ve somatostatin hormonlarını kodlayan genlerin in vitro sentezleri gibi

Bu yöntem başarılı olmasına karşın zaman alıcı ve masraflıdır Çok miktarda amino asit sayısına sahip olan proteinleri kodlayan DNA segmentleri, ayrı ayrı sentezlendikten sonra birleştirilirler Son yıllarda, özel aletler (DNA sentetizerler) yardımı ile istenilen uzunlukta DNA sekansları kolayca sentez edilebilmektedir

2) Hibridizasyon yöntemleri: Bu teknikler daha ziyade gen taşıyan DNA sekanslarının yerlerini belirlemede kullanılmaktadırlar En fazla yararlanılan yöntemler şunlardır:

a) Southern blot hibridizasyonu: Bu teknikte, materyallerden elde edilen ve bir RE ile kesimi yapıldıktan sonra oluşan saf DNA segmentlerinin agarose jel elektroforezde seperasyonu yapılır Agarose jelden sonra nitroselüloz filtresine transfer edilerek burada, işaretli (32P, biotin) problar kullanarak hibridizasyon sağlanır ve otoradiografik veya renk oluşumuna göre genin yeri belirlenir Konu üzerinde ileriki bahislerde ayrıntılı bilgi verilmektedir

Yeri saptanan DNA segmenti, agarose jel üzerinden çıkarılarak klonlamada kullanılır

b) Northern blot hibridizasyon: Bu yöntemde, agarose jel üzerine RNA separe edilerek işlemler aynen Southern blotta olduğu gibi devam ettirilir Hibrid molekülleri ortaya koymada da işaretli DNA veya RNA problarından yararlanılır

3) İstenilen genler her zaman DNA üzerinde değildir Genetik materyal olarak RNA taşıyan viruslarda, genler RNA da bulunurlar Böyle durumlarda tek iplikçik viral RNA saf olarak elde edildikten sonra, buna revers transkriptaz (RT) enzimi ile tek iplikcikli komplementer DNA (cDNA) sentezlenir Bu RNA-DNA kompleksinden RNA çıkarıldıktan sonra, bu cDNA iplikçiğine de Pol I enzimi yardımı ile ikinci bir cDNA sentezlenerek çift iplikcikli DNA molekülü haline çevrilir İşlemler, Southern blot tekniğindeki gibi yürütülür

Bazı durumlarda, geni, DNA'dan değil de, bunun bir komplementeri olan ve hücre içinde sentezlenen mRNA'dan yararlanılabilir Bu durumda mRNA'ya komplementeri olan çift iplikcikli DNA sentezlenir

Yukarıda bahsedilen ve genin yerinin belirlenmesi ve izolasyonuna yönelik çalışmalar oldukça uzun, zaman alıcı ve bazen de başarısız olabilmektedir Bu nedenle, pratikte daha etkin olan basit uygulamalar kullanılmaktadır Şöyle ki, bir RE ile kesilerek çeşitli boylarda DNA segmentleri elde edildikten sonra klonlama işlemine geçirilir ve gen taşıyan bakteri kolonileri seleksiyonla seçilerek saf olarak üretilir ve genin ekspresyonu araştırılır Aşağıda bu teknik izah edilmektedir

04 Genin Çıkarılması

DNA'larında istenen geni taşıyan bakteriler üretildikten ve DNA'ları çıkarıldıktan sonra saflaştırılır ve bir süspansiyon elde edilir Bu DNA süspansiyonu bir (veya gerekirse iki) restriksiyon endonukleaz ile muamele edilerek DNA'lar değişik boylarda olmak üzere çok sayıda segmente bölünür Doğaldır ki bu kadar çok sayıda segment (genomik DNA fragmenti) arasında istenilen (hedef) geni taşıyan sayısız sekans bulunacaktır Elde edilen DNA fragmentleri, ayrı ayrı uygun vektörle bağlandıktan sonra klonlanır Agar üzerinde oluşan koloniler, istenilen gen (hedef gen) yönünden teker teker incelenirler

Aracı moleküllerle (vektör DNA'sı ile) birleşecek olan segmentler, vektörlerin (plasmid, faj, fajmid, cosmid, vs) bakteri içindeki üremesini engellemeyecek bir boyutta ve en önemlisi de iyi eksprese olması gereklidir Bu nedenle, vektörle birleşen her DNA segmentinde istenen gen bulunmadığı gibi, gen içeren çok büyük veya küçük segmentler de vektörlerle birleşseler bile, bakteriye girmeyebilir veya girse bile eksprese olmayabilirler

Klonlamada yararlanılan bazı restriksiyon endonukleazlar bakteri genomunda kesme yaptıktan sonra oluşan segmentlerin uçları bir birinin komplementeri olup yapışkan bir özellik taşırlar (yapışkan uçlar, cohesive ends) Oluşan bu serbest uçlar tekrar birleşebilir ve sirküler bir durum alabilirler (resirkularizasyon) Bu özelliğe, vektör DNA'sında da rastlanır Her RE'nin kesiş yeri farklı olduğu gibi oluşturduğu yapışkan uçların baz sıraları ve sayıları da değişiktir

Gerek bakteriye ait DNA segmentlerinin ve gerekse vektör DNA'sının kendi aralarında tekrar birleşmesi, rekombinant DNA molekülü elde etmede güçlükler yaratmakta ve gen segmentinin vektörle birleşmesini önlemektedir Bu olumsuz duruma mani olmak için bazı metotlardan yararlanılır

Eğer genomik DNA (bakteri kromozomu), EcoRI enzimi ile kesilmişse, kesik yerlerin uçlarında birbirinin komplementeri olan ve kolayca birleşen iki yapışkan uç meydana gelir Bu durum aşağıda gösterilmiştir