Kemotaksonomi – Karşilaştirmali Fitokimya Ve Biyokimya

**Prof. Dr. Sinsi** · 10-10-2012

KEMO – ve KLASİK - TAKSONOMİ ARASI KORELASYONLAR

Her nekadar genelde bir tek kimyasal karakterin iki takson arasındaki korelasyonu kalıtsal benzerliğin mutlak kanıtı değilse de, bunun önemli istisnaları da bulunmuştur

Örneğin betaksantinler ile betasiyaninlerin ileride ele alınacağı üzere belli bazı fam

larda bulunduğu belirlenince ordoları tartışmalı olan 10 Angiosperm fam

ının taksonomisine katkıda bulunulmuştur

Çünkü kemotaksonomik sonuçlar klasik taksonomik karakterlerden elde edilen korelasyonlardan bazılarını desteklerken diğerlerini desteklememiştir

KALITSAL VARYASYONLAR
Bu yöndeki araştırmalarda kullanılan en kolay teknik serolojidir

Proteinlerin birbirleri ile uyumunu topaklanarak çökelmeleri, fluoresans- veya radyo-etiketlemeye tepkilerinin benzerlikleri, proteolitik enzimlerin sübstratı olarak verdikleri enzim aktivitesi incelenerek sonuca gidilebilmektedir

En sağlıklı yöntemler ise bilindiği gibi amino asit bileşimleri ve sekansının-dizilişinin belirlenmesidir

Örnek olarak ileride incelenecek olan flavon ve flavonoid pigmentlerinin gerek grup olarak, gerekse komponent düzeyinde birbirlerine oranla ve mutlak miktarları ile farklı renklerdeki Baptisia türlerinin birden çok geni arasında ilişki bulunmuştur

Sistematik ve Filogenetikte Modern Moleküler Biyolojik Yöntemler
1980’li yýllarýn baþlarýndan bu yana bitki sistematiðinde özellikle familya ve daha büyük gruplarýn belirlenmesi, sýnýflandýrmadaki konumlarýnýn saptanmasýnda DNA dizin analizinin 18S - 26S nükleer ribozomal RNA, yani nrRNA gen grubuna uygulanmasý çok önemli yer tutmaya baþlamýþtýr

Angiospermae’de nrDNA tekrarlayıcı birimleri birbirinden büyük ve diziliş ile boyut açısından çok değişken olan interjenik, yani genler arası dolgu (GAD) ile ayrılmıştır

Bu nrDNA birimleri dış transkripsiyon dolgusu içeren tek bir 17 - 18S transkripsiyon bölgesinden, içsel transkripsiyon dolgusu YTD ile 5

8S geni ile 2

Bir İTD ve 26S geninden oluºur

Svedberg sabiti adı verilen S değerlerinin ölçümü ve organellerin, makromoleküllerin bu büyüklük ölçüsü olan değerlerine göre ayırımı ve saflaştırılması ultrasantrfüjleme ile ve dansite – yoğunluk gradieni – değişimi santrfügasyonu tekniği uygulanarak yapılır

rRNA genlerinin tüm canlı evreninde bulunuşu yanında tekrarlanan birimin değişik oranlarda farklılık gösteren bölgelerden oluşması çeşitli taksonomik düzeylerde filojenetik bilgi vermesini sağlar

Son yıllarda İTD bölgelerinin diziliº analizilerinin ayri ayrı yapılması ile çekirdek DNA karakterlerinin ortaya çıkartılması sağlanabilmiştir

Bu şekilde de gen içi ve genler arası evrim göstergelerinin incelenmesi ve yoluyla bitkiler arasındaki evrimsel ilişkilerin kesinleştirilmesi olanağı bulunmuştur

Bir DNA izolasyon yöntemi örneði: 1999 tarihinde yayýnlanmiþ olan bu yöntemde araziden toplanan, herbaryumdan alýnan, sera veya bahçede yetiþtirilen taze veya dondurularak saklanmýþ bitki örnekleri 2X CTAB adý verilen bir ön saflaþtýrma iþleminin mikro düzeyde uygulanmasý ile moleküler biyolojik analiz tekniðinin uygulanmasýna uygun hale getirilerek DNA izolasyonu tamamlanýr:
0

05 - 0

3 gr

k

að

ölçeðinde alýnan kurutulmuþ yaprak örnekleri az miktarda saf silika tozu ile 1

5ml

lik mikrosantrfüj tübünde mikro havaneli ile kuru olarak ezildikten sonra 200 -500 mlt

2x CTAB tamponu katýlýr ve iyice ezilir

60 derecede 30 dak

inkubasyondan sonra kloroform - izoamil alkolle ekstrakte edilerek 20 mgr

da t-RNA çöktürme katkısı olarak eklenip ekstrakt santrfüjleme ile ayırıldıktan sonra alınır

Nükleik asit ekstraktı 100 ml / ml ekstrakt oranında RNaz RNA hidrolizi enzimi katılarak 30 dak

süreyle 37 derecede inkube edilir ve RNA parçalanır

Aynı ekstraksiyon işlemi 2

kez uygulanır ve pH değeri 5

2’ye ayarlı 0

3 N sodyum asetat tamponu ve alkol karışımı eklenerek çökeltilir, kurutulur ve pH 8

0 tamponunda çözülür

Polimeraz zincir reaksiyonu ve DNA baz diziliº analizi yöntemi: Tek iplikli ssDNA ile çift iplikli dsDNA diziliþ analizi örnekleri hazirlýðý “polimeraz zincir reaksiyonu - PZR, PCR ” yöntemi ile seçilen bir hedef bölgesinin amplifikasyonu, çoðaltýlmasý ile genomik DNA’lar içinde incelenebilir hale getirilir:
PZR inkubatörü olarak kullanılan programlanır Isıl Çevrim - Thermal Cycler cihazında 30 ila 35 kez olmak üzere 95 derecede 1 dak

süreli inkubasyon, 50 - 55 derecede 0

5 - 1 dak

lık, 72 derecede hedef bölgenin büyüklüğüne göre 2 - 4 dak

ve en son olarak da 7 - 10 dak

süre ile inkube edilir

“Asimetrik PZR” adı verilen ve primer - başlatıcı olarak kullanılan maddenin molar derişim oranının 20:1 oldu?u yöntemle nrDNA içindeki İTD bölgeleri çogaltılır

Elde edilen bu ürünler ultrafiltrasyonla saflaştırıldıktan sonra tipik Taq Polimeraz ile ve [ a - 35 S ] dATP kullanılarak baz diziliş analizi yapılır

Bu analiz ise oligonükleotid polimerleri kullanılarak fluoresan boyama tekniği ile DNA Diziliş Elektroforez ve tam otomatik Elektroforetik Analizör cihazları ile bilgisayar kontrolunda veya dikey DNA dizilişi elektroforez tanklarında elde edilen baz Elektoferogramlarlarının üzerinde manuel veya bilgisayarlı işaretleyici programları ile baz çiftleri karşılaştırması değerlendirme programları ile yapılır

PZR ve diziliş reaksiyonlarında nrDNA ve TD bölgelerinin ayrı ayrı belirlenebilmesi için şu primerler kullanılır:
“ITD 2” (5’- GCTGCGTTCTTCATGCATGC -3), “ITD 3” (5’- GCATCGATGAAGAACGCAGC -3),
“ITD 4” (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3), “ITD 5” (5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAGG -3)

Filogenetik analiz: Baz çiftleri diziliþlerinin karþýlaþtýrýlmasý yöntemine dayanarak oluþturulan gen bankasýnda deðerlendirme yapýlýr

Bunun için ilk olarak seçilen ÝTD alt takýmlarý çoklu diziliþ hizalamasý yazýlýmlarý ile hatasýz þekilde karþýlaþtýrýlabilir hale getirilir: Boþluklarýn boylarý ve aðýrlýklarý gibi özellikler karþýlaþtýrýlarak tek, tek dengelenir

Ön hazırlıklar tamamlandıktan sonra bu bölgelerde tek ve çoklu düzeyde olmak üzere gen katılımları ve elenmeleri ortaya çıkarılır

NrDNA ve İTD baz dizilişlerinden yararlanarak yapılan filogenetik incelemeler üç farklı soyağacı yöntemi ile elde edilen sonuçlar göz önüne alınarak yapılır: Karakter esasına göre, en yüksek benzerlik yöntemiyle ve komşuluk sınırı uzaklığının değerlendirmesiyle global bir sonuç elde edilir

Global değerlendirmeler günümüzde McIntosh ve Unix için Smithsonian Inst

tarafından geliştirilmiş özel yazılımlarla yapılmaktadır

10-10-2012	#6
Prof. Dr. Sinsi	Kemotaksonomi – Karşilaştirmali Fitokimya Ve Biyokimya KEMO – ve KLASİK - TAKSONOMİ ARASI KORELASYONLAR Her nekadar genelde bir tek kimyasal karakterin iki takson arasındaki korelasyonu kalıtsal benzerliğin mutlak kanıtı değilse de, bunun önemli istisnaları da bulunmuştur Örneğin betaksantinler ile betasiyaninlerin ileride ele alınacağı üzere belli bazı famlarda bulunduğu belirlenince ordoları tartışmalı olan 10 Angiosperm famının taksonomisine katkıda bulunulmuştur Çünkü kemotaksonomik sonuçlar klasik taksonomik karakterlerden elde edilen korelasyonlardan bazılarını desteklerken diğerlerini desteklememiştir KALITSAL VARYASYONLAR Bu yöndeki araştırmalarda kullanılan en kolay teknik serolojidir Proteinlerin birbirleri ile uyumunu topaklanarak çökelmeleri, fluoresans- veya radyo-etiketlemeye tepkilerinin benzerlikleri, proteolitik enzimlerin sübstratı olarak verdikleri enzim aktivitesi incelenerek sonuca gidilebilmektedir En sağlıklı yöntemler ise bilindiği gibi amino asit bileşimleri ve sekansının-dizilişinin belirlenmesidir Örnek olarak ileride incelenecek olan flavon ve flavonoid pigmentlerinin gerek grup olarak, gerekse komponent düzeyinde birbirlerine oranla ve mutlak miktarları ile farklı renklerdeki Baptisia türlerinin birden çok geni arasında ilişki bulunmuştur Sistematik ve Filogenetikte Modern Moleküler Biyolojik Yöntemler 1980’li yýllarýn baþlarýndan bu yana bitki sistematiðinde özellikle familya ve daha büyük gruplarýn belirlenmesi, sýnýflandýrmadaki konumlarýnýn saptanmasýnda DNA dizin analizinin 18S - 26S nükleer ribozomal RNA, yani nrRNA gen grubuna uygulanmasý çok önemli yer tutmaya baþlamýþtýr Angiospermae’de nrDNA tekrarlayıcı birimleri birbirinden büyük ve diziliş ile boyut açısından çok değişken olan interjenik, yani genler arası dolgu (GAD) ile ayrılmıştır Bu nrDNA birimleri dış transkripsiyon dolgusu içeren tek bir 17 - 18S transkripsiyon bölgesinden, içsel transkripsiyon dolgusu YTD ile 58S geni ile 2 Bir İTD ve 26S geninden oluºur Svedberg sabiti adı verilen S değerlerinin ölçümü ve organellerin, makromoleküllerin bu büyüklük ölçüsü olan değerlerine göre ayırımı ve saflaştırılması ultrasantrfüjleme ile ve dansite – yoğunluk gradieni – değişimi santrfügasyonu tekniği uygulanarak yapılır rRNA genlerinin tüm canlı evreninde bulunuşu yanında tekrarlanan birimin değişik oranlarda farklılık gösteren bölgelerden oluşması çeşitli taksonomik düzeylerde filojenetik bilgi vermesini sağlar Son yıllarda İTD bölgelerinin diziliº analizilerinin ayri ayrı yapılması ile çekirdek DNA karakterlerinin ortaya çıkartılması sağlanabilmiştir Bu şekilde de gen içi ve genler arası evrim göstergelerinin incelenmesi ve yoluyla bitkiler arasındaki evrimsel ilişkilerin kesinleştirilmesi olanağı bulunmuştur Bir DNA izolasyon yöntemi örneði: 1999 tarihinde yayýnlanmiþ olan bu yöntemde araziden toplanan, herbaryumdan alýnan, sera veya bahçede yetiþtirilen taze veya dondurularak saklanmýþ bitki örnekleri 2X CTAB adý verilen bir ön saflaþtýrma iþleminin mikro düzeyde uygulanmasý ile moleküler biyolojik analiz tekniðinin uygulanmasýna uygun hale getirilerek DNA izolasyonu tamamlanýr: 005 - 03 gr kað ölçeðinde alýnan kurutulmuþ yaprak örnekleri az miktarda saf silika tozu ile 15mllik mikrosantrfüj tübünde mikro havaneli ile kuru olarak ezildikten sonra 200 -500 mlt 2x CTAB tamponu katýlýr ve iyice ezilir 60 derecede 30 dak inkubasyondan sonra kloroform - izoamil alkolle ekstrakte edilerek 20 mgr da t-RNA çöktürme katkısı olarak eklenip ekstrakt santrfüjleme ile ayırıldıktan sonra alınır Nükleik asit ekstraktı 100 ml / ml ekstrakt oranında RNaz RNA hidrolizi enzimi katılarak 30 dak süreyle 37 derecede inkube edilir ve RNA parçalanır Aynı ekstraksiyon işlemi 2 kez uygulanır ve pH değeri 52’ye ayarlı 03 N sodyum asetat tamponu ve alkol karışımı eklenerek çökeltilir, kurutulur ve pH 80 tamponunda çözülür Polimeraz zincir reaksiyonu ve DNA baz diziliº analizi yöntemi: Tek iplikli ssDNA ile çift iplikli dsDNA diziliþ analizi örnekleri hazirlýðý “polimeraz zincir reaksiyonu - PZR, PCR ” yöntemi ile seçilen bir hedef bölgesinin amplifikasyonu, çoðaltýlmasý ile genomik DNA’lar içinde incelenebilir hale getirilir: PZR inkubatörü olarak kullanılan programlanır Isıl Çevrim - Thermal Cycler cihazında 30 ila 35 kez olmak üzere 95 derecede 1 dak süreli inkubasyon, 50 - 55 derecede 05 - 1 daklık, 72 derecede hedef bölgenin büyüklüğüne göre 2 - 4 dak ve en son olarak da 7 - 10 dak süre ile inkube edilir “Asimetrik PZR” adı verilen ve primer - başlatıcı olarak kullanılan maddenin molar derişim oranının 20:1 oldu?u yöntemle nrDNA içindeki İTD bölgeleri çogaltılır Elde edilen bu ürünler ultrafiltrasyonla saflaştırıldıktan sonra tipik Taq Polimeraz ile ve [ a - 35 S ] dATP kullanılarak baz diziliş analizi yapılır Bu analiz ise oligonükleotid polimerleri kullanılarak fluoresan boyama tekniği ile DNA Diziliş Elektroforez ve tam otomatik Elektroforetik Analizör cihazları ile bilgisayar kontrolunda veya dikey DNA dizilişi elektroforez tanklarında elde edilen baz Elektoferogramlarlarının üzerinde manuel veya bilgisayarlı işaretleyici programları ile baz çiftleri karşılaştırması değerlendirme programları ile yapılır PZR ve diziliş reaksiyonlarında nrDNA ve TD bölgelerinin ayrı ayrı belirlenebilmesi için şu primerler kullanılır: “ITD 2” (5’- GCTGCGTTCTTCATGCATGC -3), “ITD 3” (5’- GCATCGATGAAGAACGCAGC -3), “ITD 4” (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3), “ITD 5” (5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAGG -3) Filogenetik analiz: Baz çiftleri diziliþlerinin karþýlaþtýrýlmasý yöntemine dayanarak oluþturulan gen bankasýnda deðerlendirme yapýlýr Bunun için ilk olarak seçilen ÝTD alt takýmlarý çoklu diziliþ hizalamasý yazýlýmlarý ile hatasýz þekilde karþýlaþtýrýlabilir hale getirilir: Boþluklarýn boylarý ve aðýrlýklarý gibi özellikler karþýlaþtýrýlarak tek, tek dengelenir Ön hazırlıklar tamamlandıktan sonra bu bölgelerde tek ve çoklu düzeyde olmak üzere gen katılımları ve elenmeleri ortaya çıkarılır NrDNA ve İTD baz dizilişlerinden yararlanarak yapılan filogenetik incelemeler üç farklı soyağacı yöntemi ile elde edilen sonuçlar göz önüne alınarak yapılır: Karakter esasına göre, en yüksek benzerlik yöntemiyle ve komşuluk sınırı uzaklığının değerlendirmesiyle global bir sonuç elde edilir Global değerlendirmeler günümüzde McIntosh ve Unix için Smithsonian Inst tarafından geliştirilmiş özel yazılımlarla yapılmaktadır