Kemotaksonomi – Karşilaştirmali Fitokimya Ve Biyokimya

**Prof. Dr. Sinsi** · 10-10-2012

ENZİM SEÇİCİLİĞİ ve AKTİVİTESİ
İncelenmesi zor bir parametre olan enzim seçiciliği özellikle filogenetik açıdan önemli bilgiler verebilmektedir

Enzim seçiciliğindeki farklar tepkime etkinliğini etkileyen fizyolojik koşullar, sübstrat seçimi üzerinden tepkime ürünü farklılıkları gibi önemli sonuçlar yaratır

Kalıtsal şifre farklılıkları, genlerin etkin olup, olmayışı bir enzimin varlığı, yokluğu yanında çalışır durumda olup olmayışı, yani seçicilik farklılıkları gibi etmenler canlılarda farklılaşmalara neden olur

Aynı sübstratı kullanan, veya aynı ko-enzim için rekabet eden enzimlerden birinin daha etkin oluşu ikincil metabolizmanın yönünü değiştirir

Bu tür farklılıklar özellikle flavonoidler, alkaloidler gibi çok komponentli ikincil metabolitlerin kompozisyonunu ve gözlemlenebilir özelliklerini çok değiştirebilir

Farklı materyallerden elde edilmiş olup, aynı işleve sahip enzim proteinlerinin özellikleri tamponla soğukta ekstrakte edilmelerinden başlayarak sıcaklık, pH, sübstrat tipi ve derişimi, kofaktör madde ve derişimi gibi enzim aktivitesini etkileyen tüm etmenlerin, diğer koşullar sabit tutulduğunda hangi düzeylerinde en yüksek aktiviteyi sağladıkları deney serileri ile ortaya çıkarılır

Doku parçalanması nedeniyle enzim aktivitesine ket vuran madde veya maddelerin varlığı görülürse enzim saflaştırması ile uzaklaştırıldıktan sonra karşılaştırma yapılarak deneyler tekrarlanır

Enzim seçiciliğinde önemli olan diğer bir etmen ise enzimlerin sübstratı stereokimyasal özelliğine göre de ayırt etme özellikleri olabilmektedir

Bunun önemli örnekleri birçok ikincil metabolitin kaynağı olan şikimik asit sentezi yolunda, alkol dehidrojenaz etkisiyle ve NAD+ varlığında etanol – asetaldehit dönüşümünde görülebilmektedir:
Etanolün CH3 ve OH gruplarındaki H’ların elektriksel yük dağılımları farklılık gösterir, bu nedenle biri HR, HS ile gösterilir

CH3 grubundaki 3 H’dan ikisinin simetrik konumda oluşu bu dengesizliği yaratır

Bu tür elektriksel yük dağılımının etkisi altındaki C atomunun bulunduğu gruba kiral merkez adı verilir

Dehidrojenasyon enzimi ise bu konuda seçici olduğundan H gibi her organik molekülde bol bulunan H’u uzaklaştırma tepkimesini ancak etanol sübstratı ile sağlar

Bu tür duyarlı mekanizmaların enzim seçiciliğine dayanan etiketleme yöntemiyle metabolik yol incelemelerinde göz önüne alınması gerekir

Örneğin malat sentetaz enzimi etkisi ile kiral asetik asit, glioksilik asit – CoA türevi üzerinden malik aside dönüşürken kaybedilen H’ların HR, HS oluşuna göre seçicilik olduğundan kullanılacak işaretli H’a sahip sübstratın doğru seçilmemesi analiz sonucunun yanlış çıkmasına neden olur

KARŞILAŞTIRMALI SEROLOJİ
Nümerik taksonomi kadar yararlý bilgiler saðlayan bir yöntemdir

Temel prensibi bir organizmanýn proteinlerinin akraba olduðu bir canlýnýn antikorlarý ile yakýnlýk derecesi oranýnda daha kuvvetli olarak tepkimeye girmesine dayanýr

20

yüzyýlýn en baþlarýnda bulunan bu teknik týbbi immünolojide uzun süre kullanýlýp geliþtirildikten sonra diðer bilim dallarýnda da deðerlendirilmeye baþlanmýþtýr

Ýlgili proteinlerin yapýlarýnýn benzerlik oraný arttýkça, amino asit diziliþleri ve polipeptid zincirinin kývrýlmalarý gibi küçük farklýlýklarýn antiserumla uyumu azaltmasý akrabalýk derecesi açýsýndan yararlý bilgiler verebilir

Karbohidratlar gibi maddelerin mekanizmayý etkileyebilmeleri nedeniyle saflaþtýrýlmýþ protein ekstraktlarý ile çalýþýlmasý gerekir

Genelde bir canlýnýn deðiþik protein ekstraktlarý çapraz serolojik reaksiyon sonuçlarý vermez ve bu da amino asit diziliþlerinin çok benzer olmadýðýný, farklý genlerin ürünleri olduklarýný gösterir

Protein molekülünün büyük kısmının genel işlevini sağlayan sabit bir yapı olup, küçük bir kısmının kalıtsal farklılıkları yansıtır oluşu nedeniyle bir tek tip proteinin yapısı başka bir canlıınn tek bir proteini ile karşılaştırılarak kesin bir taksonomik sonuç elde edilmesi zordur

Çünkü bir protein tek bir genin ürünüdür

Fakat seroloji genelde uygulanması kolay ve çabuk sonuç veren bir teknik olarak ek kanıt olarak kullanılabilmektedir

20

yüzyıl başlarından itibaren serolojik titrasyon iki taksanın çeşitli türleri arasındaki benzerlik, afinite ilişkisi kullanılmaya başlanmış, 1930’ların başlarında da nümerik taksonomide kullanılmak üzere formüle edilerek yararlanılmıştır

Formül heterolog ve homolog yani çökelek veren ve vermeyen serolojik titrasyonların oranına dayandırılmış ise de istenen sonuçların alınamadığı görülmüştür

Ancak Nefelometri tekniğinin gelişmesi sayesinde 1950’lerden bu yana heterolog serolojik çökelme titrasyonunun duyarlı şekilde izlenebilmesi sağlanabilmektedir

Özellikle tohum protein ekstraktlarından farklı seyreltmeler ile elde edilen serolojik çözeltilerin verdiği çökelme ürünü tanecik derişimlerinin karşılığı olarak nefelometrede elde edilen değerlerin eğrisi çizilmektedir

Bu eğrilerin altındaki alanın integralle hesabı, bilgisayarda bulunması veya planimetre ile ölçümü gibi değerlendirmelerle bu alanın büyüklüğünün homolog türasyonla elde edilen eğrilere % oranı üzerinden sonuca gidilmektedir

Belli oranlarda ayırılarak saflaştırılmış ekstraktların serolojik çapraz tepkime sonuçları hiçbir zaman tek bir taksonomik karakter ile korale edilemeyen, ancak birçok ve bilinmeyen sayıdaki farklı karakterin bileşkesi olduğundan genelde nümerik taksonomide doğrudan kullanılamamakta ancak genel değerlendirmelere alınabilmektedir

Ancak modern protein fraksiyonlama teknikleri ile saflaştırılmış proteinler arası serolojik ilişkiler daha sağlıklı sonuç verebilmektedir

İstendiğinde bu proteinlerin ve peptidlerinin İnce Tabaka Kromatografisi ve Elektroforezinden, Jel Elektroforezi, bilgisayarlı ve otomatik Amino Asit Analizörlere kadar açılım gösteren tekniklerle bileşimleri ve bilgisayarlı otomatik Protein Diziliş Analizörlerle de amino asit diziliş analizi yapılarak çok daha kesin sonuçlar alınması mümkündür

INFRARED VE YAKIN İNFRARED İLE NMR SPEKTROSKOPİSİ GİBİ SPEKTROSKOPİK TEKNİKLER
Proteinlerin saflaştırılmış çözeltileri yanında liyofilize edilmiş, dondurarak kurutulmuş saf formlarının küçük moleküler farklılıklarının keton, aldehit, karboksil, hatta atom bileşimi düzeyindeki farklılıklarının belli dalgaboylarındaki soğurma, geçirgenlik veya yansıtma spektrumlarına yansımasından yararlanılarak farklılıklarınınn oldukça kolay incelenebilmesini sağlayan IR geçirgenlik / soğurma ve yansıtma teknikleridir

Bu tekniklerle birçok primer ve sekonder metabolitin de nitel ve yarınicel veya nicel analizleri yapılabildiğinden ve uygulanmaları birçok zaman kolaylık sağladığından yararlı bilgiler verebilmektedirler

NIR – Yakın IR tekniği ise daha az kalabalık spektrumlarda örneklerin tüm matriks olarak benzerlik ve farklılıklarını çok kolay, hiç örnek hazırlığı yapmadan dahi verebilen ve yarınicel analiz sonuçlara çok kolay gidebilen bir tekniktir

Matriks ve moleküllerin farklılıklarını, farklılık oranını çok kısa sürede verebilir

NMR ise atom düzeyindeki farklılıklara kadar farkların ayrıntılı şekilde incelenebilmesini sağlar

1960’lı yıllardan günümüze kadar geçerliliğini koruyan tekniklerden biri de çeşitli spektroskopik yöntemlerin mikroskopi ile birlikte uygulanabilmesini sağlayan ve sito -, histo – kimyasal ve enzimatik bilgilerin hücre düzeyinde nitel ve yarınicel şekilde elde edilmesini sağlayan tekniklerdir

10-10-2012	#7
Prof. Dr. Sinsi	Kemotaksonomi – Karşilaştirmali Fitokimya Ve Biyokimya ENZİM SEÇİCİLİĞİ ve AKTİVİTESİ İncelenmesi zor bir parametre olan enzim seçiciliği özellikle filogenetik açıdan önemli bilgiler verebilmektedir Enzim seçiciliğindeki farklar tepkime etkinliğini etkileyen fizyolojik koşullar, sübstrat seçimi üzerinden tepkime ürünü farklılıkları gibi önemli sonuçlar yaratır Kalıtsal şifre farklılıkları, genlerin etkin olup, olmayışı bir enzimin varlığı, yokluğu yanında çalışır durumda olup olmayışı, yani seçicilik farklılıkları gibi etmenler canlılarda farklılaşmalara neden olur Aynı sübstratı kullanan, veya aynı ko-enzim için rekabet eden enzimlerden birinin daha etkin oluşu ikincil metabolizmanın yönünü değiştirir Bu tür farklılıklar özellikle flavonoidler, alkaloidler gibi çok komponentli ikincil metabolitlerin kompozisyonunu ve gözlemlenebilir özelliklerini çok değiştirebilir Farklı materyallerden elde edilmiş olup, aynı işleve sahip enzim proteinlerinin özellikleri tamponla soğukta ekstrakte edilmelerinden başlayarak sıcaklık, pH, sübstrat tipi ve derişimi, kofaktör madde ve derişimi gibi enzim aktivitesini etkileyen tüm etmenlerin, diğer koşullar sabit tutulduğunda hangi düzeylerinde en yüksek aktiviteyi sağladıkları deney serileri ile ortaya çıkarılır Doku parçalanması nedeniyle enzim aktivitesine ket vuran madde veya maddelerin varlığı görülürse enzim saflaştırması ile uzaklaştırıldıktan sonra karşılaştırma yapılarak deneyler tekrarlanır Enzim seçiciliğinde önemli olan diğer bir etmen ise enzimlerin sübstratı stereokimyasal özelliğine göre de ayırt etme özellikleri olabilmektedir Bunun önemli örnekleri birçok ikincil metabolitin kaynağı olan şikimik asit sentezi yolunda, alkol dehidrojenaz etkisiyle ve NAD+ varlığında etanol – asetaldehit dönüşümünde görülebilmektedir: Etanolün CH3 ve OH gruplarındaki H’ların elektriksel yük dağılımları farklılık gösterir, bu nedenle biri HR, HS ile gösterilir CH3 grubundaki 3 H’dan ikisinin simetrik konumda oluşu bu dengesizliği yaratır Bu tür elektriksel yük dağılımının etkisi altındaki C atomunun bulunduğu gruba kiral merkez adı verilir Dehidrojenasyon enzimi ise bu konuda seçici olduğundan H gibi her organik molekülde bol bulunan H’u uzaklaştırma tepkimesini ancak etanol sübstratı ile sağlar Bu tür duyarlı mekanizmaların enzim seçiciliğine dayanan etiketleme yöntemiyle metabolik yol incelemelerinde göz önüne alınması gerekir Örneğin malat sentetaz enzimi etkisi ile kiral asetik asit, glioksilik asit – CoA türevi üzerinden malik aside dönüşürken kaybedilen H’ların HR, HS oluşuna göre seçicilik olduğundan kullanılacak işaretli H’a sahip sübstratın doğru seçilmemesi analiz sonucunun yanlış çıkmasına neden olur KARŞILAŞTIRMALI SEROLOJİ Nümerik taksonomi kadar yararlý bilgiler saðlayan bir yöntemdir Temel prensibi bir organizmanýn proteinlerinin akraba olduðu bir canlýnýn antikorlarý ile yakýnlýk derecesi oranýnda daha kuvvetli olarak tepkimeye girmesine dayanýr 20 yüzyýlýn en baþlarýnda bulunan bu teknik týbbi immünolojide uzun süre kullanýlýp geliþtirildikten sonra diðer bilim dallarýnda da deðerlendirilmeye baþlanmýþtýr Ýlgili proteinlerin yapýlarýnýn benzerlik oraný arttýkça, amino asit diziliþleri ve polipeptid zincirinin kývrýlmalarý gibi küçük farklýlýklarýn antiserumla uyumu azaltmasý akrabalýk derecesi açýsýndan yararlý bilgiler verebilir Karbohidratlar gibi maddelerin mekanizmayý etkileyebilmeleri nedeniyle saflaþtýrýlmýþ protein ekstraktlarý ile çalýþýlmasý gerekir Genelde bir canlýnýn deðiþik protein ekstraktlarý çapraz serolojik reaksiyon sonuçlarý vermez ve bu da amino asit diziliþlerinin çok benzer olmadýðýný, farklý genlerin ürünleri olduklarýný gösterir Protein molekülünün büyük kısmının genel işlevini sağlayan sabit bir yapı olup, küçük bir kısmının kalıtsal farklılıkları yansıtır oluşu nedeniyle bir tek tip proteinin yapısı başka bir canlıınn tek bir proteini ile karşılaştırılarak kesin bir taksonomik sonuç elde edilmesi zordur Çünkü bir protein tek bir genin ürünüdür Fakat seroloji genelde uygulanması kolay ve çabuk sonuç veren bir teknik olarak ek kanıt olarak kullanılabilmektedir 20yüzyıl başlarından itibaren serolojik titrasyon iki taksanın çeşitli türleri arasındaki benzerlik, afinite ilişkisi kullanılmaya başlanmış, 1930’ların başlarında da nümerik taksonomide kullanılmak üzere formüle edilerek yararlanılmıştır Formül heterolog ve homolog yani çökelek veren ve vermeyen serolojik titrasyonların oranına dayandırılmış ise de istenen sonuçların alınamadığı görülmüştür Ancak Nefelometri tekniğinin gelişmesi sayesinde 1950’lerden bu yana heterolog serolojik çökelme titrasyonunun duyarlı şekilde izlenebilmesi sağlanabilmektedir Özellikle tohum protein ekstraktlarından farklı seyreltmeler ile elde edilen serolojik çözeltilerin verdiği çökelme ürünü tanecik derişimlerinin karşılığı olarak nefelometrede elde edilen değerlerin eğrisi çizilmektedir Bu eğrilerin altındaki alanın integralle hesabı, bilgisayarda bulunması veya planimetre ile ölçümü gibi değerlendirmelerle bu alanın büyüklüğünün homolog türasyonla elde edilen eğrilere % oranı üzerinden sonuca gidilmektedir Belli oranlarda ayırılarak saflaştırılmış ekstraktların serolojik çapraz tepkime sonuçları hiçbir zaman tek bir taksonomik karakter ile korale edilemeyen, ancak birçok ve bilinmeyen sayıdaki farklı karakterin bileşkesi olduğundan genelde nümerik taksonomide doğrudan kullanılamamakta ancak genel değerlendirmelere alınabilmektedir Ancak modern protein fraksiyonlama teknikleri ile saflaştırılmış proteinler arası serolojik ilişkiler daha sağlıklı sonuç verebilmektedir İstendiğinde bu proteinlerin ve peptidlerinin İnce Tabaka Kromatografisi ve Elektroforezinden, Jel Elektroforezi, bilgisayarlı ve otomatik Amino Asit Analizörlere kadar açılım gösteren tekniklerle bileşimleri ve bilgisayarlı otomatik Protein Diziliş Analizörlerle de amino asit diziliş analizi yapılarak çok daha kesin sonuçlar alınması mümkündür INFRARED VE YAKIN İNFRARED İLE NMR SPEKTROSKOPİSİ GİBİ SPEKTROSKOPİK TEKNİKLER Proteinlerin saflaştırılmış çözeltileri yanında liyofilize edilmiş, dondurarak kurutulmuş saf formlarının küçük moleküler farklılıklarının keton, aldehit, karboksil, hatta atom bileşimi düzeyindeki farklılıklarının belli dalgaboylarındaki soğurma, geçirgenlik veya yansıtma spektrumlarına yansımasından yararlanılarak farklılıklarınınn oldukça kolay incelenebilmesini sağlayan IR geçirgenlik / soğurma ve yansıtma teknikleridir Bu tekniklerle birçok primer ve sekonder metabolitin de nitel ve yarınicel veya nicel analizleri yapılabildiğinden ve uygulanmaları birçok zaman kolaylık sağladığından yararlı bilgiler verebilmektedirler NIR – Yakın IR tekniği ise daha az kalabalık spektrumlarda örneklerin tüm matriks olarak benzerlik ve farklılıklarını çok kolay, hiç örnek hazırlığı yapmadan dahi verebilen ve yarınicel analiz sonuçlara çok kolay gidebilen bir tekniktir Matriks ve moleküllerin farklılıklarını, farklılık oranını çok kısa sürede verebilir NMR ise atom düzeyindeki farklılıklara kadar farkların ayrıntılı şekilde incelenebilmesini sağlar 1960’lı yıllardan günümüze kadar geçerliliğini koruyan tekniklerden biri de çeşitli spektroskopik yöntemlerin mikroskopi ile birlikte uygulanabilmesini sağlayan ve sito -, histo – kimyasal ve enzimatik bilgilerin hücre düzeyinde nitel ve yarınicel şekilde elde edilmesini sağlayan tekniklerdir