Ligasyon - Genetik Bağlama Nedir?

**Prof. Dr. Sinsi** · 10-09-2012

Bağlama veya ligasyon, rekombinant DNA teknolojisinde klonlanacak geni taşıyan DNA parçaları ile vektörün bir enzim aracığılıyla birbirlerine bağlanması işlemine denir

Bu işlem için ligaz cinsi enzimler görev yapar

Bağlamadaki sorunlardan biri vektörün yabancı DNA’ya bağlanması yerine kendi uçlarının birleşip halka şeklini kazanmasıdır, bunu engellemek için yapılan uygulamalardan biri, vektörün 5′ uçlarındaki fosfat gruplarının yokedilerek fosfodiester bağ oluşumunu önlemektir

Bağlama için uygun uçların bulunması ya da oluşturulması gerekir

Değişik yöntemlerle bu gerçekleştirilebilir:

Kesme enzimleri tarafından meydana getirilen yapışkan uçların birbirini tanıması şeklinde bağlanma

Aynı cins enzimle kesilmiş DNA parçaları ve doğrusal konuma getirilmiş taşıyıcı DNA molekülleri biraraya getirildiğinde, farklı kökenlere sahip olsalar bile, birbirlerini tamamlayıcı özellikteki (yapışkan) uçları taşımalarından dolayı uçlar arasındaki baz eşleşmeleriyle moleküller bağlanır

Sonrasında ligaz enzimi nükleotidler arasında fosfodiester bağları kurarak açık uçları kapatır

Bu yöntem rDNA elde etmek için kullanılan en basit ve etkili yoldur

Ligaz yüksek yoğunlukta kullanılırsa rekombinant oranı artarken, düşük yoğunlukta kullanıldığında DNA parçaları halka şeklini alırlar

Bağlayıcı ya da aracı moleküller kullanarak bağlanma

Bu yöntem küt olan uçların bağlanmasında kullanılır

Aracı olarak yapay bağlayıcı moleküller kullanılmaktadır

Bu sentetik aracı moleküller 6-10 baz çiftinden oluşan oligonükleotidlerdir

Bu moleküller 5′ uçları polinükleotid kinaz ile fosforlanma sonrası T4 DNA ligaz yardımıyla küt uçlu parçalara bağlanır ve bir kesme enzimi yardımıyla yapışkan uçlar oluşturulur

Bu şekilde oluşturulmuş diğer bir taşıyıcıya bağlanma ve aralıkların ligazla kapatılmasıyla bağlanma işlemi tamamlanır

Homopolimerik tek zincirli kuyruklar kullanarak bağlanma

Bu yöntemle de küt uçların bağlanması sağlanmaktadır

Küt uçların 3′ uçlarında terminal transferaz enzimi yardımıyla homopolimerik tek zincirli kuyruklar takılır

Bu yöntem özellikle ökaryotik genlerin çoğaltılmasında kullanılmaktadır

Ökaryotik cDNA parçalarının taşıyıcılara bağlanmasında kuyruklama yöntemi başarılı sonuçlar vermektedir

10-09-2012	#1
Prof. Dr. Sinsi	Ligasyon - Genetik Bağlama Nedir? Bağlama veya ligasyon, rekombinant DNA teknolojisinde klonlanacak geni taşıyan DNA parçaları ile vektörün bir enzim aracığılıyla birbirlerine bağlanması işlemine denir Bu işlem için ligaz cinsi enzimler görev yapar Bağlamadaki sorunlardan biri vektörün yabancı DNA’ya bağlanması yerine kendi uçlarının birleşip halka şeklini kazanmasıdır, bunu engellemek için yapılan uygulamalardan biri, vektörün 5′ uçlarındaki fosfat gruplarının yokedilerek fosfodiester bağ oluşumunu önlemektir Bağlama için uygun uçların bulunması ya da oluşturulması gerekir Değişik yöntemlerle bu gerçekleştirilebilir: Kesme enzimleri tarafından meydana getirilen yapışkan uçların birbirini tanıması şeklinde bağlanma Aynı cins enzimle kesilmiş DNA parçaları ve doğrusal konuma getirilmiş taşıyıcı DNA molekülleri biraraya getirildiğinde, farklı kökenlere sahip olsalar bile, birbirlerini tamamlayıcı özellikteki (yapışkan) uçları taşımalarından dolayı uçlar arasındaki baz eşleşmeleriyle moleküller bağlanır Sonrasında ligaz enzimi nükleotidler arasında fosfodiester bağları kurarak açık uçları kapatır Bu yöntem rDNA elde etmek için kullanılan en basit ve etkili yoldur Ligaz yüksek yoğunlukta kullanılırsa rekombinant oranı artarken, düşük yoğunlukta kullanıldığında DNA parçaları halka şeklini alırlar Bağlayıcı ya da aracı moleküller kullanarak bağlanma Bu yöntem küt olan uçların bağlanmasında kullanılır Aracı olarak yapay bağlayıcı moleküller kullanılmaktadır Bu sentetik aracı moleküller 6-10 baz çiftinden oluşan oligonükleotidlerdir Bu moleküller 5′ uçları polinükleotid kinaz ile fosforlanma sonrası T4 DNA ligaz yardımıyla küt uçlu parçalara bağlanır ve bir kesme enzimi yardımıyla yapışkan uçlar oluşturulur Bu şekilde oluşturulmuş diğer bir taşıyıcıya bağlanma ve aralıkların ligazla kapatılmasıyla bağlanma işlemi tamamlanır Homopolimerik tek zincirli kuyruklar kullanarak bağlanma Bu yöntemle de küt uçların bağlanması sağlanmaktadır Küt uçların 3′ uçlarında terminal transferaz enzimi yardımıyla homopolimerik tek zincirli kuyruklar takılır Bu yöntem özellikle ökaryotik genlerin çoğaltılmasında kullanılmaktadır Ökaryotik cDNA parçalarının taşıyıcılara bağlanmasında kuyruklama yöntemi başarılı sonuçlar vermektedir